0

ژن رمز دهنده عامل رشد فیبروبلاست (hbFGF)، پیشتر در انستیتو پاستور ایران به طور شیمیایی سنتز و سپس در ناقل pET3a کلون گردیده بود. در این مطالعه، میـزان بیـان پـروتئیـن نوترکیب این ژن با ژن حاصل از کتابخانهcDNA ، مقایسه گردیده است. با کمک فن PCR ژن hbFGF از بسته ژنی pBR322-cDNA (هدیه از طرف دکتر Seno ژاپنی)، تقویت و مکانهای آنزیمی BglII و NdeI در آن ایجاد گردید. محصول PCR در مکان SmaI ناقل pUC18 کلون شد و این ناقل نوترکیب، 1003-pUC خوانده شد. سپس قطعه مورد نظر با کمک آنزیم BamHI جدا گردید و دوباره در ناقل بیان گر - pET-3a - کلون گردید (1004-(pET. سرانجام ناقل نوترکیب اصلی 1005-pET طراحی و ساخته شد. سپس میزان بیان پروتئین نوترکیب ناقل اخیر براساس فنونی مانند Western-blotting, SDS-PAGE و ELISA با ناقل بیان گر محتوی ژن سنتیتک مورد مقایسه قرار گرفت. نتایج نشان می دهد که میزان بیان پروتئین نوترکیب ناقل 1005-pET، بسیار بیشتر از (16میلی گرم در لیتر محیط کشت) ناقل محتوی ژن سنتتیک (025/0 میلی گرم در لیتر محیط کشت) می باشد. هرچند که ژن حاصل از سنتز شیمیایی، براساس کلیدهای رمز رایج (Codon Usage) باکتری کلی باسیل طراحی شده است. بنـابـرایـن بنظـر می رسـد کـه نوع کلید رمز مصرفی، نقشی در بهبود میزان بیان این ژن نداشته باشد.

برای ارزیابی نقش پروموتر طبیعی ژن فنیل آلانین باسیلوس اسفریکوس در بیان ابتدا این ژن در ناقل شاتل pHY300PLK کلون شد و سپس در سلولهای باسیلوس سوبتیلیس و کلی باسیل ترانسفورم (تراریخت) گردید. ناقل شاتل نوترکیب pHYDH تنها در سلولهای باسیلوس به مقدار 4700 واحد آنزیمی در لیتر محیط کشت ابراز شد. سطح بیان این آنزیم نوترکیب درحدود 12% پروتئین های قابل تخلیص میکروارگانیسم بود. براساس دو آزمایش SDS-PAGE و ستون سفادکس جی 200 وزن مولکولی زیرواحد آنزیمی حدود 41 کیلو دالتون و آنزیم کامل 340 کیلو دالتون (هشت زیر واحد مشابه) تخمین زده شد. راندمان تخلیص و فولد آنزیم به ترتیب 31% و 18% به دست آمد. مقادیر Km برای ال- فنیل آلانین ال تیروزین و NAD به ترتیب 24/0، 48/0 و 19/0 میلی مولار به دست آمد. pH مناسب برای واکنش رفت دآمیناسیون اکسیداتیو 11 و واکنش برگشت آمیناسیون رداکتیو 2/10 بود. خصوصیات بیوشیمیایی آنزیم نوترکیب با نوع طبیعی آن مشابه تشخیص داده شد.

بیماری هاری به طور گسترده در تمامی استانهای ایران شایع است. این مطالعه دربرگیرنده فن Polymerase   Chain   Reaction   (PCR) برای تشخیص و همچنین روش Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) برای تعیین تیپ های مخلتف ویروس هاری و تمایز آنها با ویروس های وابسته به هاری می باشد. علاوه براین PCR به طور حتم وسیله قوی برای مطالعه اپیدمیولوژیک این ویروس و تجزیه و تحلیل سویه های مختلف ویروس هاری بدون استفاده از کشت سلول می باشد.  در این مطالعه، 50 نمونه ویروس هاری جداشده از مغز میزبانهای مختلف دریافتی از شهرستانهای مختلف کشور به روش RFLP بر روی ژن y که ناحیه متغیر ژنوم این ویروس است مورد بررسی قرارگرفت. نتایج نشان دهنده آن است که این ویروس ها به گروه ژنوتیپ/سروتیپ 1 تعلق دارند.

0