بیماری نیوکاسل یکی از مخرب ترین بیماری های ویروسی طیور در سرتاسر جهان است. باتوجه به اینکه روش های سنتی قابلیت محدودی در کنترل این بیماری دارند، هدف از انجام این مطالعه استفاده از تکنولوژی های نوین برای تشخیص به موقع بیماری جهت کاهش خسارت پیش روی صنعت طیور می باشد. در این مطالعه به منظور تشخیص ویروس نیوکاسل، یک روش Real-time-PCR بهینه سازی گردید. استخراج RNA با استفاده از کیت RNease mini (شرکت کیاژن، آمریکا) و بر اساس دستورالعمل شرکت سازنده استخراج شد.RNA استخراج شده با 68.23×109 رونوشت اولیه به صورت سری رقت های 100ml برای انجام واکنش Real-time PCR تهیه شد. در این آزمایش از سویه B1 واکسن ویروس استفاده شد. آزمایش Real-time-PCR با استفاده از کیت تجاری ساخت شرکت Genekam Biotechnology کشور آلمان انجام شد. حساسیت واکنش Real-time PCR با توجه به سری رقت های تهیه شده 34-10×1 رونوشت/میکرولیتر تعیین گردید. با توجه به اینکه سرعت و دقت تشخیص ویروس نیوکاسل در همه گیری ها، نقش مهمی در کنترل بیماری دارد. استفاده از این روش به عنوان یک روش تشخیصی با حساسیت بالا توصیه می گردد.

یکی از چالش های موجود در تفسیر نتایج qPCR، اطمینان از اختصاصی بودن قطعات تکثیر شده است که برای بررسی آن از آنالیز منحنی ذوب استفاده می شود. پیک های اضافی در منحنی ذوب همیشه نشان دهنده یک مشکل نیست، به همین منظور در این مقاله یک ابزار مبتنی بر وب به نام uMelt SM به عنوان راهکاری کاربردی و ساده برای آنالیز صحیح منحنی ذوب به محققین پیشنهاد می گردد که امکان پیش بینی منحنی ذوب DNA و پروفیل های واسرشته سازی را با وضوح بالای فلورسنت از محصولات PCR فراهم می کند. نتایج این مطالعه نشان داد که منحنی های ذوب براساس چه پارامترهایی تولید شده و الگوریتم مناسب برای نحوه کار با این نرم افزار ارائه گردید. در نهایت ژن های اکتین و سوپراکسید دیسموتاز از قارچ Pyricularia oryzae به عنوان الگوی مناسب برای تعیین منحنی پیش بینی شده با استفاده از این نرم افزار ارائه گردید و منحنی Real-time PCR نیز ترسیم شد. براساس نتایج منحنی ذوب با استفاده از نرم افزار uMelt SM در مقایسه با منحنی ذوب دستگاه Real-time PCR تطابق بالایی را نشان می دهد که این نتایج تأییدی بر مزیت هایی همچون سهولت استفاده، صرفه جویی در زمان، هزینه و تلاش در بخش تجربی با استفاده از این نرم افزار می باشد.

روش Real-time PCR در سال های اخیر به عنوان روشی انتخابی جهت تشخیص بسیاری از بیماری های عفونی در آزمایشگاه ها مورد استفاده قرار گرفته است. با استفاده از این فن آوری، واکنش زنجیره پلیمراز توسط مولکول های گزارش گر فلورسنت انجام و از این طریق، تولید فرآورده های تکثیری طی هر چرخه واکنش PCR گزارش می شود. بدین ترتیب مجموعه ای از خصوصیات از جمله، حساسیت و اختصاصیت بالا، داده های قابل اعتماد و خطر پایین آلودگی، فن آوری Real-time PCR را به جایگزینی مناسب برای PCR معمولی تبدیل کرده است. این روش اغلب در تعیین کمیت سطوح بیان ژن نیز مورد استفاده قرار می گیرد. از آنجایی که تمامی مراحل Real-time PCR در داخل یک لوله دربسته انجام می شود، خطر ایجاد آلودگی در آن در مقایسه با PCR معمولی بسیار کاهش یافته و در نتیجه از حصول نتایج مثبت کاذب جلوگیری می شود. هدف از این مقاله، مرور کلی در مورد انواع مختلف روش Real-time PCR، مزایا و کاربردهای آن می باشد.

طی سال های 1388-1389 از روش real time RT-PCR و RT-PCR معمولی جهت شناسایی ویروس زبان آبی در 310 گوسفند مشکوک به بیماری زبان آبی استفاده شد. قطعاتS1  (ژن پلی مراز) و S10 (ژن NS3) بعنوان ژنهای حراست شده در گروه سرمی زبان آبی به ترتیب توسط  rRT-PCR و RT-PCR معمولی مورد آزمایش قرار گرفتند و در نهایت تعداد 58 (%18.6) و 14 (%4.5) نمونه مثبت شناسایی شدند. جهت ارزیابی حساسیت rRT-PCR نسبت به RT-PCR معمولی از رقت های لگاریتمی RNA ویروس زبان آبی (BTV16) استفاده شد. نتایج حاکی از آن بود که با روش RT-PCR عیار بیش 103.8 TCID50/ml قابل شناسایی است، در حالیکه در روش rRT-PCR مرز تشخیص در حد101.8 TCID50/ml  از RNA ویروس در نمونه های بالینی می باشد. در این مطالعه مشخص شد روش rRT-PCR از حساسیت فوق العاده ایی برخوردار است. دام هائی که در انتهای بیماری هستند و عیار ویروسی در خون آنها بسیار کاهش یافته است با این روش قابل شناسایی می باشند. در این مطالعه سعی شد از برخی از نمونه های مثبت که باروش rRT-PCR شناسایی شدند، جداسازی ویروس صورت گیرد. برای این منظور از روش تزریق به عروق کوریوآلانتوئید تخم مرغ جنین دار و کشت سلول Vero و KC استفاده شد. علیرغم تلاش های صورت گرفته جداسازی ویروس امکان پذیر نشد.

هدف: کالپاستاتین در بافت عضله اسکلتی حیوانات یافت شده است و می تواند با سرکوب فعالیت کالپاین مانع از رشد بی رویه سلولی شود. دخالت کالپاین ها در آپوپتوزیز موضوعی است که هنوز مورد بحث است، اگرچه دخالت آنها محدود به انواع خاصی از سلول ها و محرک های خاص است. مطالعات مختلف نشان داده که این ژن در عملکرد رشد و کیفیت گوشت نقش دارد، لذا هدف این پژوهش بررسی میزان بیان ژن کالپاستاتین در بافت های مختلف بز کرکی راینی با استفاده از Real time PCR بود. مواد و روش ها: در مجموع 21 نمونه بافتی شامل ماهیچه، کلیه، قلب، جگر، شش، طحال و چربی (از هر بافت 3 تکرار) از 3 بز کرکی راینی در هنگام کشتار در کشتارگاه تهیه شد. RNA کل استخراج و cDNA ساخته شد. برای برررسی میزان نسبی بیان ژن ها از واکنش Real time PCR به روش SYBR Green استفاده شد. در این مطالعه از ژن گلیسرآلدئید 3 فسفات دهیدروژناز (GAPDH) به عنوان ژن کنترل داخلی استفاده شد. برای تجزیه و تحلیل داده های حاصل از Real time PCR از روش پی فافل استفاده شد. نتایج: برای ژن کالپاستاتین قطعه bp89 و برای GAPDH قطعه bp101 در همه نمونه ها مشاهده شد. نتایج Real time PCR حاصل از این پژوهش نشان داد که ژن کالپاستاتین در تمامی بافت های بررسی شده (ماهیچه، کلیه، قلب، جگر، شش، طحال و چربی) بیان شده است و بیشترین سطح بیان در بافت قلب، طحال و جگر و کمترین سطح بیان در بافت چربی مشاهده شد. نتیجه گیری: نتایج نشان می دهد که ژن کالپاستاتین در بافت های مختلف بز گسترده است. همچنین این پژوهش اساسی را برای انجام پژوهش های بیشتر در مورد کالپاستاتین در بز کرکی راینی ایجاد نمود. پیشنهاد می شود که این مطالعه با تعداد دام بیشتر، جنس های مختلف، سنین متفاوت و مراحل فیزیولوژیکی گوناگون در نژادهای مختلف بز انجام شود تا بتوان به یک نتیجه گیری جامعی دست یافت.

سابقه و هدف: پیشگیری از تولد بیماران مبتلا به سندرم داون (تریزومی 21) از اولویت های وزارت بهداشت می باشد. هدف این مطالعه، تشخیص سریع بیماران مبتلا به سندرم داون با استفاده از تکنیک Real-time PCR کمی به منظور پایه گذاری روشی جدید برای تشخیص قبل از تولد است.روش بررسی: در این مطالعه تجربی، ابتدا از افراد مورد مطالعه نمونه خون گرفته شد. پس از استخراج DNA ژنومی، میزان ژن DYRK1A2 در لنفوسیت های افراد مبتلا به سندرم داون و طبیعی با تکنیک Real-time PCR کمی سنجش شد.یافته ها: نسبت ژنی DYRK1A2/PMP22 در لنفوسیت های افراد طبیعی و بیماران مبتلا به تریزومی 21 به ترتیب 09/0±1 و 13/0±68/1 به دست آمد (p<0.001) که حضور سه کپی از ژن DYRK1A2 در افراد تریزومی 21 را نشان داد.نتیجه گیری: نسبت ژنی DYRK1A2/PMP22 مبتلایان به سندرم داون به طور معنی داری بیشتر از افراد طبیعی است. بنابراین از تکنیک Real-time PCR کمی با استفاده از DNA ژنومیک می توان بعنوان روشی بسیار دقیق، معتبر و نوین در تشخیص سریع تریزومی 21 استفاده کرد.