زیست شناسی میکروبی
سال:1403 | دوره:13 | شماره:49 |تعداد مقالات:7

هدف این پژوهش بررسی رفتار و پایداری پادزیستی باکتری های کشت پذیر در پی افزایش سه پادزیست پرکاربرد در سه خاک کشاورزی، چراگاه و معدن با اندازه های گوناگون فلزهای سنگین بود.پادزیست های آموکسی سیلین، سفیکسیم و مترونیدازول هریک به اندازه های 100 و 200 میلی گرم در کیلوگرم سه خاک کشاورزی، معدن و چراگاه به کار رفتند و در یک بازه کوتاه مدت (صفر، 1، 3 و 7 روز) فراوانی باکتری ها در کشتگاه های نوترینت آگار و درصد باکتری های پایدار در کشتگاه نوترینت آگار دارای پادزیست (16 میکروگرم آموکسی سیلین، 2 میکروگرم سفیکسیم، 8 میکروگرم جنتامایسین، 16 میکروگرم مترونیدازول و 8 میکروگرم تتراسایکلین در میلی لیتر نوترینت آگار) شمارش و برآورد شد.درصد باکتری های پایدار در برابر پادزیست های سفیکسیم، جنتامایسین و تتراسایکلین در خاک معدن به ویژه چراگاه که آلودگی زیادی به فلزهای سنگین داشتند، بیشتر از خاک کشاورزی بود و تنها درصد باکتری های پایدار در برابر آموکسی سیلین و مترونیدازول در خاک کشاورزی بیش از معدن بود. در خاک چراگاه 100 درصد باکتری ها در برابر پادزیست های آزمون شده به جز تتراسایکلین پایداری داشتند. تیمار خاک ها به آموکسی سیلین باعث افزایش درصد باکتری های پایدار شد که این افزایش به ویژه در خاک کشاورزی در غلظت 200 میلی گرم بر کیلوگرم نمایان تر بود. همین یافته در کاربرد سفیکسیم نیز دیده شد؛ اما در خاک معدن غلظت بالای این پادزیست پیامد کاهشی نشان داد و درصد باکتری های پایدار در دو خاک چراگاه و کشاورزی نزدیک 100 درصد بود و در خاک معدن به کمتر از 20 درصد رسید. درصد باکتری های پایدار در خاک های تیمارشده با مترونیدازول نیز در برابر خاک های تیمارنشده افزایش چشمگیر داشت؛ اما در این تیمار پاسخ باکتری های خاک کشاورزی به غلظت 200 میلی گرم بر کیلوگرم کاهشی بود و خاک معدن چنان پاسخی را نداشت.به طور کلی در همه تیمارها توان باکتری کشی تتراسایکلین و سپس جنتامایسین در غلظت های به کاررفته در کشتگاه در برابر سه پادزیست آموکسی سیلین، سفیکسیم و مترونیدازول بیشتر بود. پایداری پادزیستی باکتری های خاک به آلودگی خاک به فلزهای سنگین و گوناگونی باکتری های خاک، اندوخته ژنتیک و توان جابه جایی ژن های پایداری در میان آنها وابسته است. تنش همزمان آلودگی فلز و پادزیست ها در خاک، با توجه به ویژگی های خاک و پادزیست باعث چیرگی گونه های ویژه و پایدار می شود که می تواند باعث افزایش جابه جایی ژن های پایداری و فراوان شدن آنها شود.

در سال های اخیر، نیاز صنایع مختلف کشور به آنزیم ال-آسپاراژیناز افزایش یافته است. ال-آسپاراژیناز به دست آمده از ریزموجودات، مقرون به صرفه و بدون آثار زیان بار زیست محیطی است و سبب افزایش کیفیت محصولات می شود. در پژوهش حاضر، مخمرهای مولد ال-آسپاراژیناز از منابع مختلف خاک جداسازی و بهینه سازی شدند و میزان تولید آنزیم سویۀ منتخب بررسی شد.مخمرهای مولد آنزیم ال-آسپاراژیناز به طور تصادفی از خاک نقاط مختلف شهر اصفهان جداسازی و خالص سازی شدند. سویه ها از نظر میزان تولید ال-آسپاراژیناز در محیط کشت حداقل آسپاراژین آگار غربال گری شدند و سویۀ مخمر برتر که بیشترین فعالیت آنزیمی را داشت، برای بهینه سازی انتخاب شد. در شرایط مناسب اسیدیته، دما، زمان، منبع کربن و منبع نیتروژن، بهینه سازی چندفاکتوره با نرم افزار آماری سطح پاسخ به منظور بررسی تأثیر هم زمان چند فاکتور بر بیشترین میزان فعالیت آنزیمی انجام شد.در مطالعۀ حاضر، جدایۀ مخمری 5S2 سبب تشکیل بیشترین هالۀ ال-آسپاراژینازی شد. این سویه برای نخستین بار به عنوان سویۀ مولد ال-آسپاراژیناز معرفی و با نام سویۀ Diutina mesorugosa strain SBG-IAUF-2 به شماره دسترسی MZ901211 در پایگاه اطلاعاتی NCBI ثبت شد. مخمر 5S2 با فعالیت آنزیمی معادل u/ml 8/1722 به عنوان سویۀ منتخب برای بهینه سازی تعیین شد. نتایج بهینه سازی چندفاکتورۀ فعالیت آنزیم نشان دادند در اسیدیتۀ 7، غلظت 2 درصد گلوکز به عنوان منبع کربن، غلظت 10 درصد ال-آسپاراژین، دمای 35 درجۀ سانتی گراد و زمان 120 ساعت، بیشترین فعالیت آنزیمی وجود دارد و منحنی RSM در منطقۀ بهینه سازی قرار دارد.در پژوهش حاضر برای نخستین بار، جدایۀ مخمر 5S2 به عنوان سویۀ مولد ال-آسپاراژیناز در پایگاه اطلاعاتی NCBI ثبت و باتوجه به فعالیت آنزیمی زیاد ال-آسپاراژیناز خارج سلولی تولیدشده توسط این سویه، سویۀ مخمر 5S2 به عنوان سویه ای قوی در تولید آنزیم ال-آسپاراژیناز معرفی شد.

یکی از نگرانی های دنیای امروز آلودگی های زیست محیطی ناشی از فلزات سنگین است و در این خصوص، عنصر سلنیوم به دلیل مقدار کم در محیط، از اهمیت به سزایی برخوردار است. حذف زیستی فلزات یکی از پاک ترین و ارزان ترین روش های جذب زیستی است. هدف از انجام این پژوهش، جداسازی و ارزیابی سویه های مقاوم به سلنیوم برای حذف زیستی این فلز از محیط های آبی است. با جداسازی سویه های مقاوم به سلنیوم، میزان جذب زیستی انواع منتخب در شرایط مختلف اسیدیته، دما و مقدار توده زیستی در زمان های مختلف بررسی شدند. در این بین، دو جدایه به غلظت 400 میلی مولار سدیم سلنیت مقاوم بودند که پس از انجام آزمون های بیوشیمایی و ژنتیکی شناسایی شدند. بالاترین میزان جذب ازنظر میزان توده زیستی تلقیحی مربوط به تالازوسپیرا پرمنسیس و باسیلوس تورنجینسیس در میزان توده 4 درصد به ترتیب طی 20 و 60 دقیقه بود. بیشترین میزان میانگین جذب توسط باسیلوس در اسیدیته 5 طی 40 دقیقه و برای تالازوسپیرا در اسیدیته 7 و زمان 60 دقیقه صورت گرفت. دمای بهینه برای دو سویه، 25 درجه سانتی گراد به دست آمد و مشخص شد در این دما تالازوسپیرا پرمنسیس طی 20 دقیقه و باسیلوس تورنجینسیس طی 40 دقیقه بهترین اثر را داشتند. همچنین مشخص شد تالازوسپیرا پرمنسیس با جذب 1/95 درصد سلنیوم کل با مقدار 4 درصد توده زیستی در مدت زمان 20 دقیقه، در اسیدیته برابر با 6 و دمای 25 درجه سانتی گراد بهترین گزینه برای جذب زیستی سلنیوم بود. تالازوسپیرا پرمنسیس با جذب 1/95 میلی گرم بر لیتر از مقدار 100 میلی گرم بر لیتر سدیم سلنیت موجود در محیط طی 20 دقیقه و با بیومس 4 درصد، از میزان جذب زیستی بالایی برخوردار بود و توانست کاندیدای مناسبی برای مطالعات بعدی حذف سلنیوم از پساب مربوطه باشد.

این مطالعه با هدف ارزیابی میزان شیوع جدایه‎های کمپیلوباکتر بر اساس وجود برخی ژن های تهاجمی انجام گرفت. در این مطالعه تجربی در شهرستان بهبهان 392 نمونه بعد از کشت، با استفاده از رنگ آمیزی گرم از نظر آلودگی بررسی شد. سپس شناسایی ملکولی جدایه‎های کمپیلوباکتر با انجام PCR و با استفاده از پرایمرهای مناسب برای ژن های تهاجمی cdtA,B,C، cadF، pldA، ciaB و 16S rRNA انجام شد.  بر اساس نتایج رنگ آمیزی گرم 50 نمونه آلوده به جنس کمپیلوباکتر بودند. که از این میان تعداد نمونه‎های مرغ 37 (74%) مورد، گاو 8 (16%) مورد، گوسفند و بز 2 (4%) مورد و آب 3 (6%) مورد آلوده به کمپیلوباکتر بوده‎اند. آنالیز توالی ژن 16S rRNA نشان داد، که 72% آلودگی مربوط به کمپیلوباکتر ژژونی و 28% مربوط به کمپیلوباکتر کلی می‎باشد. در کل شیوع کمپیلوباکتر ژژونی در نمونه‎های جدا شده به طور معنی‎داری بیشتر از کمپیلوباکتر کلی بود (012/0= p). در جدایه کمپیلوباکتر ژژونی بیشترین شیوع مربوط به ژن تولید سمCdtC  (2/76 %) و در جدایه کمپیلوباکتر کلی مربوط به ژن تولید سم CdtB (2/30 %) بوده است. به طور کلی اگر چه مرغ‎ها به عنوان منابع اصلی گونه‎های کمپیلوباکتر مطرح هستند، اما لازم است که اهمیت دیگر منابع آلودگی به ویژه گاو و گوسفند برای ارزیابی نقش آن‎ها در عفونت‎های انسانی، نیز بررسی شود. بنابراین برای مصرف انسان حتما باید احتیاط‎های لازم به عمل آید و رعایت نکات بهداشتی در محل نگهداری، در طول خط کشتار و در فروشگاه‎ها صورت گیرد.

با توجه به روند رو به رشد سویه های مقاوم به چند داروی استافیلوکوکوس ساپروفیتیکوس، جست وجو برای شناسایی عوامل ضدمیکروبی جایگزین بیشتر شده است. برای این منظور، در تحقیق حاضر بررسی متابولیت های ثانویه آنابنا سیانوباکتری بر بیان ژن های مقاومت وانکومایسین استافیلوکوس ساپروفیتیکوس جداشده از سالمندان انجام شد. طی دو ماه، 120 نمونۀ بالینی مختلف از سالمندان مراجعه کننده به بیمارستان های شهر تهران جمع آوری شد. ایزوله های استافیلوکوکوس ساپروفیتیکوس با استفاده از تست های فنوتیپی و شیمیایی شناسایی شدند. سپس با استفاده از روش های مولکولی حضور ژن های Van شناسایی شد. سپس با استفاده از روش میکروبراث دایلوشن حساسیت ایزوله های باکتریایی نسبت به متابولیت ثانویه سیانوباکتر آنابنا سنجیده شد. در انتها میزان بیان ژن های Van نسبت به 16SrRNA با استفاده از روش Real Time PCR در ایزوله های استافیلوکوکوس ساپروفیتیکوس تیمارشده با متابولیت ثانویه سیانوباکتر اندازه گیری شد. در این مطالعه با استفاده از تست های فنوتیپی از 83 ایزوله باکتری جداسازی شده از نمونه های بالینی، تنها 8 ایزوله به عنوان استافیلوکوکوس ساپروفیتیکوس شناسایی شد. از 8 ایزوله استافیلوکوکوس ساپروفیتیکوس 1 ایزوله واجد ژن VanA و 2 ایزوله واجد ژن VanB بودند. MIC متابولیت ثانویه سیانوباکتر 750 میکروگرم / میلی لیتر و sub-MIC 325 میکروگرم / میلی لیتر علیه ایزوله های استافیلوکوکوس ساپروفیتیکوس بود. میزان بیان ژن VanA و VanB در سویه های تیمارشده با متابولیت ثانویه سیانوباکتر نسبت به ژن مرجع (16SrRNA) کاهش یافت. یافته های این مطالعه نشان می دهند متابولیت ثانویه سیانوباکتر دارای اثر ضدمیکروبی قوی است و سبب کاهش بیان ژن های مقاومت به آنتی بیوتیک می شود که برای توسعه نسل جدید داروهای ضد استافیلوکوکوس می تواند استفاده شود.

پایداری آنزیم ها به حرارت و pH از مهم ترین شاخصه های تعیین کننده در کاربرد آنهاست. در این تحقیق دستیابی به سلولاز پایدار در برابر حرارت و pH، با غربالگری در یکی از چشمه های گراب واقع در شمال شرق ایران هدف گذاری شد.نمونه های جمع آوری شده از یکی از چشمه های آب گرم گراب، در استان خراسان رضوی در ایران، برای جداسازی، ارزیابی و شناسایی باکتری های قادر به تولید سلولاز پایدار در برابر حرارت استفاده شدند. کشت ها در دمای 45 درجه سانتی گراد و در شرایط هوازی گرمخانه گذاری و جدایه ها روی محیط CMC آگار جداسازی شدند. غربالگری اولیه جدایه ها مبتنی بر محیط کشت اختصاصی، تحمل پذیری به نمک و دما انجام شد. سپس غربالگری تکمیلی آنها با ارزیابی فعالیت اندوگلوکانازی در دماها و pH مختلف به روش کیفی و کمی سنجش انجام شد. در نهایت، شناسایی مولکولی جدایه انتخابی با روش تعیین توالی ژن 16S rRNA انجام شد. نتایج حاصل از این تحقیق منجر به معرفی سویه انتخابی نمک دوست نسبی با نام انتسابی G362 Bacillus sp. با پایداری قابل توجه فعالیت اندوگلوکانازی در دمای 55 درجه سانتی گراد و پایداری در طیف وسیعی از  pH اسیدی و قلیایی شد. چشمه مطالعه شده مانند برخی از چشمه های آب گرم ایران دارای باکتری مولد سلولاز است که سویه منتخب این تحقیق، با قابلیت رشد در نمک 6 درصد و تولید آنزیم اندوگلوکاناز مقاوم به حرارت و پایداری عملکردی بالا در طیف وسیع  pHقلیایی و اسیدی می تواند برای مطالعات بیشتر به کار گرفته شود. علاوه بر این، ژن اختصاصی اندوگلوکاناز جدایه G362 Bacillus sp. را می توان شناسایی مولکولی کرد و برای تحقیقات بیشتر از جمله مطالعات ساختاری استفاده نمود. حتی ممکن است به عنوان یک الگوی پروتئین در مهندسی پروتئین استفاده شود.

مطالعه و شناسایی روش های تشخیصی سریع با حساسیت بالا، بسیار شایان توجه قرار گرفته است؛ ازجمله نانوبیوسنسورهای آنزیمی که به سرعت، نتایج را براساس یک واکنش آلی پیشرفته بین نانوذره، آنزیم و سوبسترا نشان می دهند. در این مطالعه، نانوذرات اکسید روی، اکسید قلع و نانولوله های کربنی چندجداره ساده و عامل دار، به عنوان مولکول های مارکر به همراه آنزیم بتاگالاکتوزیداز استفاده شدند. پس از سنتز، ساختار نانوذرات با آنالیزهای XRD، FTIR و  UV-DRS تأیید شد. فعالیت آنزیمی بتاگالاکتوزیداز در حضور ONPG تعیین شد. مقادیر مختلف نانوذرات در حضور آنزیم با مقدار ثابت، استفاده و بهترین مقدار، در مهار فعالیت لاکتازی آنزیم تعیین شد. در مرحله بعد، غلظت های مختلفی از باکتری اشرشیا کلای (108-101) به محیط، اضافه و توانایی هریک از نانوذرات در تشخیص باکتری با هم مقایسه شد. این ترکیبات به دلیل اندازه کوچک، مساحت سطحی و واکنش پذیری بالا، قادر به تشخیص کمترین مقدار باکتری در محیط بودند. درواقع باکتری ها پس از حضور در محیط به نانوذرات، متصل و مانع از اتصال آنها به آنزیم شدند که این امر به شروع فعالیت آنزیمی منجر شد. نتایج نشان دادند نانولوله های کربنی، قدرت بیشتری در شناسایی باکتری هدف دارند و توانستند حداقل غلظت CFU/ml 10 از باکتری را در کمتر از 15 دقیقه شناسایی کنند. از نانوذرات می توان برای تشخیص حداقل آلودگی های میکروبی در کمترین زمان، به ویژه در صنعت مواد غذایی استفاده کرد.