میکروبیولوژی دامپزشکی (پژوهشنامه دامپزشکی گرمسار)
سال:1398 | دوره:15 | شماره:2 (پیاپی39) |تعداد مقالات:12

لپتوسپیروز یکی از بیماری های مهم قابل انتقال از حیوان به انسان است. LipL32 یکی از مهمترین پروتئین های غشای خارجی لپتوسپیرا است که تنها در سرووارهای بیماری زا وجود دارد و فاکتور مناسبی جهت شناسایی لپتوسپیراهای بیماری زا می باشد. بنابراین هدف از انجام این پژوهش، تشخیص مولکولی لپتوسپیراهای بیماری زا بر اساس ژن lipL32 می باشد. در این بررسی از سرووارهای بیماری زا و غیر بیماری زای استاندارد لپتوسپیرا استفاده شد. باکتری ها در محیط کشت اختصاصیEMJH کشت داده شدند و DNA ژنومیک آن ها با روش استاندارد فنول کلروفرم ایزوآمیل الکل تخلیص گردید. پرایمر اختصاصی جهت تکثیر ژن lipL32طراحی شد. دمای اتصال (Annealing) برای این پرایمر 61 درجه سانتی گراد، غلظت مناسب پرایمر 10 پیکومول، میزان حساسیت 4-10 pg/µ l و همچنین تعیین ویژگی آن در PCR مورد بررسی قرار گرفت. با توجه به داده های PCR تایید شد که این ژن فقط در سرووارهای بیماری زای لپتوسپیرا حضور دارد و قطعه bp 272 حاصل که نشان دهنده تکثیر ژن lip L32 می باشد، در سرووار غیر بیماری زا مشاهده نگردید. شناسایی روش های سریع تشخیص لپتوسپیراهای بیماری زا پیش از ورود به فاز حاد بیماری بسیار حائز اهمیت می باشد. بنابراین جهت تشخیص لپتوسپیراهای بیماری زا، روش های مولکولی مبتنی بر PCR با استفاده از ژن lipL32که در کوتاه ترین زمان ممکم پاسخی دقیق و قابل اعتماد ارائه می دهند، پیشنهاد می گردد.

چکیده یکی از توصیه های مهم انجمن های مرتبط با حیوانات آزمایشگاهی، استفاده از حیوانات با فلور میکروبی مشخص است زیرا که نتایج کار بر روی آنها بایستی تکرار پذیر، مطمئن و قابل تعمیم باشد. بنابراین انجام پایش های بهداشتی حیوانات جهت صدور گواهی وضعیت سلامت آنها در مراکز تولید و پرورش حیوانات آزمایشگاهی الزامی است. از میان ویروس های توصیه شده توسط FELASA، ویروس تیلر عامل انسفالومیلیت از مهمترین آنها بوده که در این تحقیق به بررسی حضور آن در جمعیت موش های آزمایشگاهی نژاد NIH یک مرکز پرورش حیوانات آزمایشگاهی پرداخته شده است. روش تحقیق در این بررسی، RT-PCR، با استفاده از پرایمرهای اختصاصی ویروس مورد نظر بوده است. طراحی و تهیه نمونه کنترل مثبت، با استفاده از ترانسفورمیشن پلاسمید حاوی مناسب ترین قطعه ژن ویروس در E. coli جهت تکثیر ژن بود و سپس استخراج آن صورت گرفت. نمونه ها از بافت روده (کولون) حاوی مدفوع حیوانات، تهیه و به روش استاندارد آماده-سازی و سپس روش RT-PCR انجام گرفت. نتایج نشان می دهد تعداد 13 نمونه از 29 نمونه و با میزان شیوع 45% در بین موش های نژاد NIH مبتلا به این ویروس بوده اند. محصول PCR انجام شده تخلیص و تعیین توالی گردید. در بررسی همترازی (alignment) جهت تعیین استرین، با توالی های هشت گونه دیگر کسب شده از بانک ژن NCBI مقایسه شد. در درخت فیلوژنی، سویه KX774639 0. 15874 متعلق به این تحقیق بیشترین قرابت را، با گونه M20562 از کشور اتریش و گونه NC_001366 از کشور انگلیس نشان داد. از آنجاکه این عفونت قابل انتقال به انسان نیست، حذف فوری کلنی ضرورت ندارد.

کشت سلول برای تولیدات بیولوژیکی و دارویی علی الخصوص دارو های دامی اهمیت ویژه ای دارد این تحقیق(کشت سلول) در شرایط کشت سوسپانسیون، انجام شده است. برای بهینه سازی مکمل های غذایی موجود در محیط کشت از روش های متفاوتی مانند تغییر تک پارامترو ثابت نگه داشتن مابقی پارامترها(فاکتوریل) استفاده میشود که بسیار زمان برو دارای خطای بالائی میشود. در این مقاله از روش طراحی آزمایش به روش تاگوچی استفاده شده که نسبت به روشهای دیگر دقت بالاتر، زمان کمتر و تعداد آزمایش کمتری انجام میشود. . با استفاده از این روش طراحی آزمایش سعی بر بهینه سازی محیط کشت مورد استفاده در پژوهش شد. با توجه به تعداد سلول نهایی، ضریب تزاید و زمان دو برابر شدن و نرخ ویژه رشد هر آزمایش محاسبه گردید و در باره اهمیت هرکدام از مکمل های غذایی و اثر آن ها بر روی سلول کلیه نوزاد همستر(Baby Hamster Kidney) اعمال نظر شده است. هرچه تعداد سلول نهایی بیشتر باشد در نتیجه زمان دو برابر شدن کمتر و نرخ ویژه رشد بیشتر می شود، که حاصل تمامی این ها باعث می شود کشت سلول بهره وری بیشتری داشته باشد. هدف از این تحقیق بررسی بر روی تاثیر مکمل های غذایی مختلف موجود در محیط کشت بر رشد و تکثیر سلول کلیه نوزاد همستر(BHK)متمرکز شده است. در فرآیند کشت سلول نتایج بدست آمده نشان دهنده بهبود رشد و تکثیر سلول ها شد. افزایش تعداد سلول به صورت کلی ( در این پژوهش سلول BHK ) موجب تولید بیشتر و با کیفیت بالاتر داروهای بیولوژیک می شود. میزان سرم اضافه شده در محیط کشت در این روش (10%) بیشترین تاثیر مثبت بر روی ضریب تزاید، زمان دو برابر شدن و نرخ ویژه رشد را دارد و هم چنین افزایش میزان اسید های آمینه(12 گرم در هر لیتر) تاثیری بر روی ضریب تزاید، زمان دو برابر شدن و نرخ ویژه رشد ندارد.

یکی از ضدعفونی کننده های پرکاربرد در صنعت طیور کشور، هیپو کلریت سدیم می باشد. باکتری اشریشیا کلی (E. coli) یکی از مهمترین میکروارگانیسم هایی است که توسط این ضدعفونی کننده کنترل می شود. امروزه، از باکتری E. coliبه عنوان باکتری مهمی در نگهداری و انتقال مقاومت های چندگانه ی دارویی و ضدعفونی کننده ها یاد می شود که می تواند این مقاومت را به سایر باکتری ها نیز منتقل کند. اینتگرون ها از جمله قطعات ژنی مهمی هستند که از طریق پذیرش و بیان ژن های مقاومت در انتقال و بروز مقاومت در باکتری های مختلف نقش دارند. در مطالعات گذشته، در کاست ژنی اینتگرون کلاس1 علاوه بر ژن های مقاومت به داروها و مواد ضدعفونی کننده ترکیبات چهارتائی آمونیوم (ژن های qacE)، توالی هایی با قالب خواندن باز (ORF)، شناسائی شده اند. تاکنون چندین ORF که ژن هائی با عملکرد ناشناخته هستند، در کاست ژنی اینتگرون کلاس1 شناسائی شده اند. در مطالعه حاضر، فراوانی اینتگرون کلاس 1و نیز ژن orfF به روش Multiplex PCR در باکتری های اشریشیا کلی جدا شده از طیور و نقش آن ها در القای مقاومت باکتری به ضدعفونی کننده هیپوکلریت سدیم با آزمایش کمترین غلظت مهاری بررسی گردید. در این مطالعه فراوانی اینتگرون کلاس1، 61 درصد به دست آمد. فراوانی حضور اینتگرون کلاس1 در میان جدایه های حاصل از نمونه های مدفوع و یا پریکارد تفاوت معناداری نداشتند. همچنین هیچ گونه ارتباط معنی داری بین فراوانی حضور اینتگرون کلاس1 و القای مقاومت به هیپوکلریت سدیم دیده نشد (05/0P>). فراوانی ژن orfF نیز 8 درصد بود که ارتباط آماری معنی داری با حضور اینتگرون کلاس1 و القای مقاومت به هیپوکلریت سدیم دیده نشد (05/0P>). علی رغم وجود فراوانی بسیار بالای اینتگرون کلاس1 در میان جدایه های مورد آزمایش، با توجه به عدم وجود ارتباط آماری بین اینتگرون کلاس1 و مقاومت به هیپوکلریت سدیم می توان نتیجه گرفت که ژن های مقاومت به این ضدعفونی کننده از طریق کاست ژنی اینتگرون کلاس1 منتقل نمی شوند و نیاز به مطالعات بیشتری در زمینه درک مقاومت به این ضدعفونی کننده وجود دارد.

مشمشه یکی از مهم ترین بیماری های قابل انتقال از حیوانات تک سمی بوده که عامل آن بورخولدریا مالئی است. با توجه به کانون بیماری در ایران و احتمال آلودگی انسان و خطرات ناشی از انتقال این باکتری، شناسایی سریع آن در حیوانات از اهمیت زیادی برخوردار می باشد. لذا هدف از این مطالعه طراحی یک روش تشخیص سریع شامل لکه نمایی نقطه ای برای تعیین حضور حضور آنتی بادی بود. برای این منظور 40 نمونه سرم اسب از استان های مختلف اخذ و به همراه نمونه آنتی ژن پیکره باکتری بورخولدریا مالئی (کنترل مثبت) و سرم اسب های سالم (کنترل منفی) مورد آزمون قرار گرفتند. غلظت بهینه آنتی ژن-آنتی بادی با استفاده از چکر بورد برای سرم های مثبت و منفی مشخص گردید. پس از طراحی آزمون لکه گذاری نقطه ای، آنتی ژن روی چاهک کاغذ نیتروسلولز قرار داده شد و تثبیت آنتی ژن با محلول بلاکینگ و سپس افزودن سرم اسب مشکوک به همراه کنترل مثبت و منفی انجام شد. در ادامه به آن آنتی بادی کونژوگه اضافه و نهایتا با افزودن سوبسترا به چاهک ها نتیجه ی واکنش به صورت ایجاد رنگ قرائت گردید. در این بررسی از 40 نمونه، شش مورد مثبت شناسایی گردید. با در نظر گرفتن مالئیناسیون به عنوان آزمون استاندارد و مقایسه آن با لکه گذاری نقطه ای به ترتیب حساسیت و ویژگی 100٪ و 9/91٪ شد. نتایج نشان داد روش لکه گذاری نقطه ای به دلیل حساسیت بالا، سرعت، سهولت قرائت و قابلیت کاربردی صحرایی آن، در صورت تایید مراجع مسئول تشخیص در عفونت با بورخولدریا مالئی می تواند استفاده شود.

واکنش زنجیره ای پلیمراز چندگانه (PCR Multiplex) یک روش پیشرفته از تکنیک های تشخیص مولکولی است که امکان شناسایی همزمان چند عامل بیماریزا را در یک نمونه فراهم می کند. مزایای استفاده از روش واکنش زنجیره ای پلیمراز چندگانه در مقایسه با نتایج تشخیص به دست آمده با روشهای متداول دیگر توسط محققان مختلف بررسی شده است. در این پژوهش از PCR چندگانه طراحی شده در آزمایشگاه به منظور شناسایی هم زمان عوامل مهم سقط جنین گوسفندان شامل: Brucella melitensis، Salmonella abortusovis، Chlamydophila abortus وCoxiella burnetii، استفاده شد. برای این منظور تعداد 98 نمونه محتویات شیردان جنین های سقط شده از سه منطقه جغرافیایی ایران شامل استان های اصفهان، چهارمحال و بختیاری و خراسان رضوی، مورد آزمایش قرار گرفت. میزان آلودگی در نمونه های بررسی شده، 15/3 درصد Brucella melitensis، 11/2 درصد Salmonella abortusovis، 7/1 درصد Chlamydophila abortus و صفر درصد Coxiella burnetii بود. در کل نتایج این پژوهش نشان می دهد که Brucella melitensis، Salmonella abortusovisوChlamydophila abortusاز مهمترین عوامل سقط جنین نشخوارکنندگان کوچک بوده و از آزمون PCR چندگانه، به خوبی می توان برای تشخیص عوامل سقط جنین در گوسفند و بز استفاده کرد.

آنفلوانزای فوق حاد پرندگان بعنوان بیماری جدی عفونی، توسط یکRNA ویروس سنس منفی متعلق به جنس آنفلوانزا و خانواده اورتومیکسوویریده ایجاد می شود. ویروس های نوع A بر اساس آنتی ژنهای گلیکوپروتئینی سطح آنها شامل هماگلوتینین(HA) و نورامینیداز (NA) به زیر گروه هایی طبقه بندی می شوند. ویروس آنفلوانزای پرندگانH5N1 با حدت بالا (HPAI)، از طریق مرغ های خانگی و پرندگان وحشی در بیش از 60 کشور منتشر شده است. در این مقاله به نحوه بیان هماگلوتنین H5 در سلولهای Sf9 حشره ای پرداخته شده است که متعلق به ویروس A/chicken/Iran/53-3/2008(H5N1) می باشد. توالی نوکلئوتیدی هماگلوتینین، از سویه ایرانی این ویروس که متعل به clade 2. 2 است، از بانک ژنی استخراج شده و پس از بهینه سازی کدون ها برای بیان در سیستم سلول حشره، توسط شرکت GenScript سنتز شد. این توالی در پلاسمید pIEx-3 که حاوی توالی پپتید ترشحی AKH و 6xHis-Tag می باشد، داخل شد. پروتئین هماگلوتینین در سلول Sf9 حشره ای، بیان شده و H5 ترشحی با وزن مولکولی 95 کیلودالتون تخلیص گردید. با استفاده از این سیستم بیانی غیر وابسته به باکلوویروس، H5 نوترکیب، در مطالعات بعدی مربوط به واکسن های مبتنی بر پروتئین، انتخاب داروها و ساخت کیت تشخیص آنفلوانزای فوق حاد پرندگان، قابل استفاده می باشد.

هدف از انجام این پژوهش برررسی اثر منبع و توازن آنیون-کاتیون جیره (DCAD) گاوهای شیری بر جمعیت پروتوزوآها، متانوژن ها، غلظت نیتروژن آمونیاکی، گاز متان و قابلیت هضم ماده خشک در شرایط آزمایشگاهی بود. برای شمارش جمعیت پروتوزوآها و متانوژن ها از تکنیک واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR)رقابتی استفاده شد. این طرح برای گاو شیری در اوایل شیردهی با میانگین580 کیلوگرم وزن بدن، سن 25 ماهگی و تولید روزانه 35 کیلوگرم در قالب آزمایش فاکتوریل 2×2×3 انجام شد. عوامل مؤثرها شامل DCAD (meq/kgDM 150+، 250+ و 350+)، منابع پتاسیمی (کربنات پتاسیم بدون آب(KC) و کربنات پتاسیم سسکوئی هیدرات (KCS)) و منابع منیزیمی (اکسید منیزیم (MO) و کربنات منیزیم (MC)) بود. اثر تیمارهای آزمایشی بر غلظت نیتروژن آمونیاکی معنی دار نبود. در همه تیمارها افزایش DCAD باعث کاهش غلظت نیتروژن آمونیاکی در شکمبه شد. اثر تیمارهای آزمایشی بر تولید گاز متان، قابلیت هضم ماده خشک، جمعیت پروتوزوآها و متانوژن ها معنی دار بود. نتایج پژوهش حاضر نشان داد که تیمار حاوی DCAD 250+ میلی اکی والان تأمین شده از دومنبع کربنات پتاسیم سسکوئی هیدرات و کربنات منیزیم باعث کاهش جمعیت پروتوزوآ، متانوژن ها، تولید متان و افزایش قابلیت هضم ماده خشک می شود. با توجه به اینکه اختلاف معنی دار بین DCAD 250+ و 350+ مشاهده نشد، بنظر می رسد که منابع کربنات پتاسیم سسکوئی هیدرات و کربنات منیزیم به همراه سطح تعادل آنیون – کاتیون جیره 250+ میلی اکی والان از طریق بهبود شرایط بافری شکمبه باعث بهبود پارامترهای تخمیر شکمبه ای می شود. بنابراین این دو منبع احتمالاً مکمل های مناسبی در جیره گاوهای شیری هستند.

بیماری بروسلوز یا تب مالت، همواره از دو بعد اقتصادی و بهداشتی حائز اهمیت بوده به نحوی که هر ساله خسارت های اقتصادی فراوانی را برای سرمایه دامی کشور به بار می آورد. از سوی دیگر از آنجایی که بروسلوز یک بیماری مشترک بین انسان و دام می باشد، اهمیت موضوع از نظر بهداشت عمومی دو چندان می شود. بنابراین لازم است با انجام مطالعات اپیدمیولوژیک به عنوان گام اول، به سمت شناسایی عامل بیماری و سپس کنترل و کاهش موارد ابتلا به آن در کشور قدم برداشت. در این مطالعه، 170 نمونه سقط جنین مربوط به گوسفند و گاو در طی سال های 94 تا 97 از استان های گلستان و خراسان رضوی جمع آوری گردید. پس از کالبد شکافی، از ارگان های مختلف جنین ها در محیط کلمبیا آگار و مک کانکی کشت داده شد و با استفاده از رنگ آمیزی گرم و تست های استاندارد بیوشیمیایی، تمام نمونه ها مورد بررسی قرار گرفتند. در مجموع، 60 ایزوله بروسلا شناسایی گردید. در نهایت با استفاده از تکنیک های مولکولی Bruce-ladder Multiplex PCR و ERIC-PCR، تفکیک گونه و تایپینگ مولکولی ایزوله های جداسازی شده انجام پذیرفت. از میان 60 ایزوله شناسایی شده، 59 گونه مربوط به بروسلا ملی تنسیس و 1 گونه مربوط به بروسلا آبورتوس بود. تمامی ایزوله های شناسایی شده، علیرغم مناطق جغرافیایی متفاوت، دارای الگوی ژنتیکی مشابهی بودند. تکنیکBruce-ladder Multiplex PCR به عنوان یک روش سریع، دقیق و ایمن جهت شناسایی بروسلا در سطح جنس و گونه بسیار موثر است. با وجود اینکه تکنیک ERIC-PCR در بسیاری از مطالعات روش قدرتمندی در تمایز مولکولی باکتری ها بشمار می رود، در صورت امکان بهتر است که برای تایید نتایج این مطالعه از تکنیک های دقیق تر و با قدرت تفکیک بالا همچون MLVA و MLST نیز استفاده گردد.

نئوسپورا کانینوم انگل تک یاخته داخل سلولی با گسترش جهانی است. این تک یاخته از عوامل اصلی سقط جنین در گاوهای شیری بوده است. تحقیق حاضر به منظور بررسی میزان شیوع فصلی و جغرافیایی نئوسپورا کانینوم در شیر نشخوارکنندگان به روش مولکولی انجام شد. چهارصد و چهل نمونه شیر خام طی چهار فصل سال از استان های اصفهان، چهارمحال و بختیاری، خوزستان و فارس جمع آوری و به آزمایشگاه منتقل شد. نمونه های DNA استخراج شده با استفاده از کیت بوسیله آزمون nested-PCR به منظور ردیابی ژن NC5 نئوسپورا کانینوم ارزیابی شدند. از مجموع 440 نمونه شیر مورد مطالعه، 54 نمونه (27/12 درصد) آلوده به نئوسپورا کانینوم بودند. شیر گاو بیشترین (26 درصد) و شیر گوسفند کمترین (4 درصد) میزان شیوع نئوسپورا کانینوم را داشتند. نمونه های شیر جمع آوری شده در فصل زمستان بیشترین (85/22 درصد) و نمونه های جمع آوری شده در فصل تابستان کمترین (57/8 درصد) میزان شیوع نئوسپورا کانینوم را داشتند. نمونه های شیر جمع آوری شده از استان چهارمحال و بختیاری بیشترین (94/14 درصد) و نمونه های جمع آوری شده از اصفهان کمترین (38/6 درصد) میزان شیوع نئوسپورا کانینوم را داشتند. با توجه به شیوع نسبی این انگل در شیر خام مورد مطالعه، اتخاذ برنامه های کنترلی بیش از پیش مورد نیاز است. همچنین با توجه به احتمال مصرف فرآورده های لبنی سنتی و انتقال آلودگی به انسان، جوشش کامل شیر قبل از مصرف توصیه می گردد.

توکسوپلاسما گونده ای یک انگل با انتشار جهانی است که می تواند حیوانات و انسان را آلوده کند. عفونت با این انگل زئونوز عمدتاً با مصرف گوشت نیم پز یا خام، که حاوی کیست های بافتی است ایجاد می شود. مطالعه حاضر به منظورپایش میدانی روش MIT درتعیین میزان آلودگی دامهای کشتارگاهی شهرستان رشت به انگل توکسوپلاسماانجام گرفته است. مطالعه حاضر به منظور تعیین شیوع عفونت توکسوپلاسموز در حیوانات اهلی در استان گیلان صورت گرفته است. در این مطالعه تجربی نمونه های سرم از 166 حیوان شامل 48 گاو، 85 گوسفند و 33 بز برای شناسایی آنتی بادی های ضد توکسوپلاسما تهیه شد و با آزمون آگلوتیناسیون اصلاح شده (MAT)بررسی شدند. آنتی بادی های ضد توکسوپلاسما در 30 نمونه سرم به دست آمده از 166حیوان (18/1%) شناسایی گردید. بالاترین میزان عفونت در گوسفند (24/7%) و به دنبال آن آلودگی در گاو (16/7%) و بز (3 %) یافت شد. بیشتر گوسفندان (23%) تیتر آنتی بادی 1: 20 داشتند. 8/7 درصد از حیوانات نر و 22/9 از ماده ها سرم مثبت بودند و این تفاوت ازنظر آماری معنی دار بود (5%>p). همچنین برحسب منطقه جغرافیایی اختلاف معنی داری دیده شد (5%>p). شیوع سرولوژیک بالای توکسوپلاسموز که در این منطقه مشاهده شد نشان می دهد که حیوانات اهلی می توانند نقش عمده ای در انتقال عفونت به انسان از طریق مصرف گوشت نیم پز داشته باشند.

ابیا ها به عنوان یک گروه از هشت گونه ی زنده ی مرغ های پا دراز در جنس اسکولوپکس (Scolopax) در نظر گرفته می شوند که در جنگل های مخلوط یا برگ ریز زندگی و معمولا به صورت منفرد مهاجرت می کنند و همچنین یکی از پرندگانی است که دارای آلودگی های انگلی است. در این پژوهش از مجموع 18 پرنده ابیا اوراسیایی (S. rusticola) (11 نر و 7 ماده) که توسط مأموران محیط زیست مازندران از شکارچیان غیر مجاز ضبط شد، به منظور مطالعه ی انگل های خارجی و داخلی مورد بررسی قرار گرفتند که در نتایج، میزان عفونت کلی انگلی در پرنده های مورد مطالعه 100 % و انگل های خارجی و داخلی پرندگان شامل دو گونه سستود (Hymenolepis spp. و Davinia proglottina)، یک گونه ترماتد (Echinoparyphium)، یک گونه جرب (Megniniacubitalis) و دو گونه شپش (Philopterus و Lipeurus) است. علاوه بر این، شایع ترین آلودگی با 22/72 درصد انگل (M. cubitalis) بوده است. یافته ها و مقایسه ی آن ها با مطالعه های دیگر نشان می دهند که ابیای اوراسیایی با توجه اهمیت مهاجرت، نقش مهمی در انتقال انگل ها داشته و نیاز به تحقیق های بیشتر در مورد این پرنده و سایر پرندگان مهاجر در ایران احساس می شود و همچنین این مطالعه نخستین گزارش انگل های مذکور در پرنده ابیا اوراسایی از ایران است.