هدف: هدف از این تحقیق، بررسی حضور ژن DBAT، یکی از ژن های کلیدی در مسیر بیوسنتزی تاکسول، در سرخدار (Taxus baccata) و قارچ اندوفیت مولد تاکسول آن و نیز بررسی میزان شباهت این توالی ها با توالی های موجود در بانک ژن بودمواد و روش ها: در این تحقیق، قارچ های اندوفیت از پوست درخت سرخدار جداسازی و به روش نوک هیف خالص سازی شدند DNA .نومی درخت سرخدار و یکی از قارچ های مولد تاکسول (ایزولهT9 ) استخراج گردید. حضور ژن DBAT به وسیله واکنش زنجیره ای پلیمراز بررسی گردید. پس از توالی یابی، میزان شباهت توالی های به دست آمده از سرخدار و ایزوله T9 با توالی های سایر گونه های سرخدار و قارچ های اندوفیت، موجود در پایگاه بانک ژن، مقایسه شدند.نتایج: با استفاده از پرایمرهای اختصاصی، یک قطعه 125bp از ژن DBAT سرخدار و ایزوله T9 تکثیر گردید. هم ردیفی توالی نوکلئوتیدی و آمینواسیدی قارچ و گیاه میزبان نشان داد که این توالی ها دارای شباهت بسیار بالایی (بیش از 98 درصد) بودند. نتایج هم ردیفی این توالی ها با توالی های گونه های دیگر سرخدار و قارچ های اندوفیت، نیز شباهت بسیار بالایی (98 تا 100 درصد) را نشان داد. همچنین، شباهت نسبتا بالایی در توالی نوکلئوتیدی و آمینواسیدی آنزیم DBAT و سایر آنزیم های آسیل و آروئیل ترانسفراز درگیر در مسیر بیوسنتزی تاکسول مشاهده شد.نتیجه گیری: بر اساس نتایج، حضور ژن DBAT در قارچ اندوفیت مولد تاکسول جداشده از سرخدار و همچنین شباهت بسیار بالا آن، در سطح نوکلئوتیدی و آمینواسیدی، با توالی بدست آمده از ژن DBAT میزبان (Taxus baccata) و توالی گونه های دیگر سرخدار و نیز قارچ های اندوفیت به اثبات رسید.

مقدمه: تاکسول یکی از مهم ترین داروهای ضدسرطان می باشد که تامین آن عمدتا به روش های زیستی وابسته می باشد. ژن 10- داستیل باکاتین III- ا- استیل ترانسفراز (DBAT) یکی از ژن های کلیدی مسیر بیوسنتزی تاکسول می باشد و می توان انتظار داشت افزایش بیان آن منجر به افزایش تولید تاکسول در سیستم های زیستی شود.هدف: بررسی ویژگی های ژن DBAT از سرخدار بومی ایران، آنالیز بیان ژن و تهیه سازه افزایش بیان ژن مذکور.روش بررسی: ابتدا توالی ژن کلون شد. خصوصیات توالی با استفاده از بررسی های بیوانفورماتیکی مشخص شد. آنالیز بیان ژن در پاسخ به الیسیتور متیل جاسمونات و در زمان های مختلف انجام شد. در نهایت به منظور تهیه سازه افزایش بیان، توالی تحت کنترل پروموتر CaMV35S وکتور pCAMBIA1304 کلون شد.نتایج: مقایسه درجه شباهت توالی مشخص نمود که توالی مذکور بیشترین مشابهت را با توالی Taxus´hunnewelliana نشان می دهد. یک جایگزینی اسید آمینه ای منحصر به فرد در توالی مشاهده شد که بررسی آن نشان داد که تغییر مذکور نمی تواند خصوصیات کلی آنزیم را تغییر دهد و بنابراین آنزیم حاصل یک آنزیم فعال می باشد. آنالیز بیان ژن نشان داد که در پاسخ به متیل جاسمونات سطوح بیان ژن به میزان حداکثر 24 برابر در 12 ساعت پس از تحریک افزایش می یابد. در پایان، درج ژن مذکور در جایگاه مناسب وکتور افزایش بیان توسط آزمون های هضمی مورد تایید قرار گرفت.نتیجه گیری: تحریک سرشاخه های بریده گیاه سرخدار می تواند روش جایگزین مناسبی برای کشت های سلولی سرخدار به منظور بررسی های بیان ژن باشد. سادگی، سهولت و حذف مرحله زمانبر کشت های سلولی از مهم ترین مزایای آن می باشد.

سرخدار یکی از با ارزش ترین منابع گیاهی است که فواید و کاربردهای متنوعی دارد. برگ این گیاه منبع خوبی برای استخراج ماده ضد سرطان تاکسول است. امروزه رویکردهای درمانی برای استفاده از داروهای گیاهی توسعه یافته است، بنابراین بررسی مسیر بیوسنتزی گیاهان دارویی از اهمیت ویژه ای برخوردار است. در این پژوهش، نمونه­های گیاهی تحت تیمار با متیل جاسمونات با غلظت های متفاوت صفر، 100، 250 و 500 میکرومولار قرار گرفتند و در دو زمان متفاوت 48 ساعت و 72 ساعت در فیتوترون نگه داری شدند. پس از اعمال تیمار، بیان ژن DBAT با روش Real Time PCR اندازه گیری شد. همچنین مقدار تاکسول تولیدی با کروماتوگرافی مایع با کارآیی بالا (HPLC) بررسی شد و اطلاعات به دست­آمده تجزیه و تحلیل شد. نتایج نشان داد که بیشترین مقدار بیان ژن با 68/1 برابر گیاه شاهد مربوط به تیمار 250 میکرومولار متیل جاسمونات در 72 ساعت بود و همچنین کمترین بیان ژن نیز با کمتر از 5 درصد گیاه شاهد مربوط به تیمار 100 میکرومولار متیل جاسمونات، در 48 ساعت محاسبه شد. در این بررسی بیشترین مقدار تاکسول تولیدی در گیاه تحت تیمار با غلظت 500 میکرومولار متیل جاسمونات و زمان 48 ساعت به مقدار 3276/0 میلی­گرم بر­گرم وزن خشک مشاهده شد. آزمون همبستگی پیرسون بیانگر این بود که هیچ رابطه معنی­داری بین مقدار بیان ژن و تاکسول تولیدی وجود ندارد. امکان دارد علت این امر اختلاف بین زمان بیان ژن و تولید تاکسول تحت تأثیر محرک متیل جاسمونات باشد.

سابقه و هدف: تاکسول یک داروی ضدسرطان با منشاء گیاهی است که به طور گسترده برای درمان انواع مختلف سرطان استفاده می شود. روش های استخراج سنتی تاکسول از گونه های سرخدار بسیار سخت و هزینه بر است. بنابراین، بررسی منابع جایگزین برای این داروی با ارزش ضروری به نظر می رسد.مواد و روش ها: در این تحقیق قارچ های اندوفیت از پوست سرخدار بومی ایران (Taxus baccata) جداسازی شدند. ایزوله ها در محیط PDB (Potato Dextrose Broth) کشت داده شده و به مدت 21 روز انکوبه شدند. DNA ژنومی نمونه ها استخراج گردید و حضور ژن DBAT (10-داستیل باکاتین استیل ترانسفراز)، یکی از ژن های کلیدی در مسیر بیوسنتزی تاکسول، با استفاده از واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) بررسی شد. عصاره گیری از کشت مایع قارچ های حاوی ژن DBAT انجام شده و تولید تاکسول در آنها به وسیله روش کروماتوگرافی لایه نازک بررسی گردید.نتایج: در مجموع 60 ایزوله قارچ اندوفیت از سرخدار بومی ایران جداسازی گردید. حضور ژن DBAT در 22 ایزوله تائید شد. نتایج کروماتوگرافی لایه نازک تولید تاکسول را در محیط کشت برخی از ایزوله ها به اثبات رساند.نتیجه گیری: در برخی از قارچ های جداشده از سرخدار ایرانی حضور ژن مسیر بیوسنتزی و هم چنین تولید تاکسول به اثبات رسید. این نتایج نشان داد که قارچ های اندوفیت مولد تاکسول سرخدار می توانند منبع جایگزین مناسبی برای تامین تاکسول باشند. مطالعات تکمیلی در این مورد درحال انجام است.

لطفا برای مشاهده چکیده به متن کامل (pdf) مراجعه فرمایید.

تاکسان ها ترکیبات دی ترپنوئیدی با اثرات ضد سرطانی شناخته شده می باشند. از مهمترین تاکسان ها تاکسول می باشد. از آنجایی که روش سنتی استخراج تاکسول از پوسته درخت، ناکارآمد و غیراقتصادی بود، تلاش ها برای یافتن روشی کارآمد در این زمینه گسترش یافت و در نهایت روش آزمایشگاهی کشت بافت و سلول مطلوب ترین شیوه در این زمینه معرفی گردید. استفاده از محرک ها از بهترین راهکارهای بهبود عملکرد و افزایش تولید متابولیت های ثانویه در کشت های سلولی می باشد. از این رو در این مطالعه، اثر دو غلظت 125/0 و 625/0 میلی گرم بر لیتر از محرک سولفات مس، طی زمان های دو و هفت روز بر میزان تاکسول و 10-دی استیل باکاتین III درکشت سوسپانسیون سلولی سرخدارمورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد در حالی که غلظت 125/0 میلی گرم بر لیتر طی هفت روز باعث افزایش معنی دار (43٪ ) 10-دی استیل باکاتین III می گردد، غلظت 625/0 میلی گرم بر لیتر در همان مدت، منجر به کاهش معنی دار تاکسول (23٪ ) و 10-DAB (16٪ ) می گردد. همچنین مطالعه اثر غلظت انتخابی 125/0 میلی گرم بر لیتر سولفات مس بر بیان چهار ژن دخیل در بیوسنتز تاکسول (txs، DBAT، bapt، dbtnbt) طی 12، 24 و 48 ساعت نشان داد که گرچه رونوشت ژن, DBATدر ساعت 12 افزایش پنج برابری داشته، اما میزان بیان سایر ژن ها بسیار کم و در حد شاهد بوده و حتی در مورد ژن txs در ساعت 24، سرکوب بیان مشاهده می گردد. گرچه افزایش معنی دار مشاهده-شده در میزان 10-دی استیل باکاتین III ناچیز است ولی همین میزان نیز با توجه به اهمیت این ماده به عنوان پیش ساز تولید تاکسول می تواند قابل تامل باشد.