کشت میکروسپور یکی از روش های کارآمد تولید گیاهان هاپلوئید میباشد. در پژوهش حاضر، سیستم کشت میکروسپور در دو رقم تتراپلوئید رز (‘Apollo و ‘Amarosa’) مورد بررسی قرار گرفت. عواملی شامل محیط جداسازی میکروسپورها (AB و B)، محیط القای جنینزایی در میکروسپورها (AT3) به همراه منابع مختلف کربوهیدرات (ساکارز، مالتوز یا گلوکز) و آمینواسید لاکتالبومین هیدرولیزات مورد مطالعه قرار گرفتند. اثر تنش های گرسنگی و دمایی به تنهایی و یا به صورت توام با مدت زمان های گوناگون بر تقسیمات متقارن (اسپروفیتی) مورد ارزیابی قرار گرفت. از میکروسپورها در مراحل مختلف نموی جهت کشت استفاده شد اما بیشتر آن ها در مرحله انتهای تک سلولی بودند. به منظور حذف آلودگی های باکتریایی و قارچی، غنچه ها قبل از کشت با اتانول 70 درصد به مدت 15، 30 و 60 ثانیه یا هیپوکلریت سدیم (3.5 درصد) به مدت 5، 10 و 15 دقیقه ضدعفونی سطحی شدند. بهترین روش ضدعفونی غنچه ها تیمار با هیپوکلریت سدیم (3.5 درصد) به مدت 10 دقیقه تشخیص داده شد. دو محیط جداسازی تفاوت معنی داری در زنده مانی میکروسپورها نشان ندادند. در میان محیط های القایی مورد بررسی، در رقم‘Amarosa’، بالاترین میزان زنده مانی میکروسپورها در محیط AT3 به همراه قند گلوکز به دست آمد. محیط های کشت القایی در رقم‘Apollo’، تفاوت معنی داری در زنده مانی میکروسپورها نشان ندادند. ترکیبی از تنش های گرسنگی و سرمایی به مدت سه روز موجب القای جنین در رقم ‘Amarosa’ گردید. در پژوهش حاضر برای اولین بار جنین زایی میکروسپورهای رز گزارش می گردد.

در بسیاری از گیاهان، آندروژنز یکی از رایج ترین روش های درون شیشه ای برای القای هاپلوئیدی است. کشت میکروسپور مؤثرترین روش آندروژنز است. در کشت میکروسپور بادمجان، پروسه جنین زایی در مرحله جنین کروی شکل متوقف شده است و تلاش ها برای غلبه بر این مشکل ادامه دارد. در این مطالعه، اثرات غلظت های مختلف صمغ عربی، ساکارز و تنظیم کننده های رشد گیاهی (6-بنزیل آمینوپورین (BAP) و 1-نفتالن استیک اسید (NAA)) روی کشت میکروسپور دو رقم بادمجان بررسی شدند. در رقم ریکاردا، بیشترین کالوس های مشتق شده از میکروسپور (711/4 کالوس در هر پتری دیش) زمانی تولید شد که 2000 میلی گرم در لیتر صمغ عربی، 2 درصد ساکارز، 0/5 میلی گرم در لیتر BAP و 0/5 میلی گرم در لیتر NAA استفاده شد. رقم شانتال با ترکیبی از 2600 میلی گرم در لیتر صمغ عربی، 2 درصد ساکارز و 0/5 میلی گرم در لیتر از BAP و NAA، بیشترین تعداد کالوس را تولید کرد (230/33 کالوس در هر پتری دیش؛ 5/27 برابر بیشتر از شاهد (43/73). نتایج همچنین نشان داد که جنین های قلبی شکل می توانند در بادمجان تولید شوند. کشت میکروسپور رقم ریکاردا در محیط کشت NLN حاوی 2600 میلی گرم در لیتر صمغ عربی، 2 درصد ساکارز و 0/5 میلی گرم در لیتر BAP و 0/5 میلی گرم در لیتر NAA منجر به پیشرفت روند تکاملی برخی از ساختارهای کروی شکل شد. در واقع، جنین های کروی به جنین های قلبی شکل تبدیل شدند که یک گام امیدوارکننده در مسیر جنین زایی میکروسپور بادمجان است.

تولید گیاهان هاپلوئید / دابلد هاپلوئید باعث سرعت بخشیدن به برنامه های به نژادی، بهبود کارآیی انتخاب، شناسایی همبستگی و اثرات متقابل ژنی، تخمین واریانس ژنتیکی و تعداد ژنهای کنترل کننده صفات کمی، تولید جابجایی های ژنتیکی و تسهیل انتقال ژن می گردد. کشت میکروسپور در برنامه های به نژادی، علاوه بر مزایای فوق دارای کاربردهای دیگری از قبیل ایجاد و حفظ گیاهان نرعقیم از طریق جنین زایی میکروسپور، امکان برگرداندن نرباروری از طریق بلوغ درون شیشه ای میکروسپور، غلبه بر خودناسازگاری و القا و انتخاب جهیده ها می باشد. در برنامه های مهندسی ژنتیک، سیستم انتقال ژن به لاین جنسی نر که شامل انتقال ژن به میکروسپور، بلوغ درون شیشه ای آن و سپس گرده افشانی دانه های گرده تراریخته است، بسیار کارآمد می باشد. در مطالعات پایه امکان برسی نمو دانه گرده و گرده افشانی، جنین زایی، توتی پوتنسی، چرخه سلولی، تغییر فاز و نقش تنش در نمو از طریق کشت میکروسپور امکان پذیر است. در این مقاله جنبه های مختلف کشت درون شیشه ای میکروسپور بررسی می گردد.

تولید لاین های خالص به وسیله القاء آندروژنز راه حلی امیدبخش و جایگزین برای برنامه های اصلاح کلاسیک می باشد. این تکنولوژی در گوجه فرنگی به توسعه و اصلاح روش ها نیازمند است. یکی از عوامل موفقیت القاء آندروژنز در گوجه فرنگی استفاده از میکروسپورهایی است که در مرحله مناسب نمو قرار داشته باشند. بررسی سیتولوژیکی دقیق ترین روش برای تعیین مرحله مناسب نمو میکروسپورها است. در این مطالعه بررسی خصوصیات سیتولوژیکی میکروسپورها و دانه های گرده در طی روند نمو طبیعی و ارتباط بین طول جوانه گل و طول بساک صورت پذیرفت. نتایج نشان داد که همبستگی بین طول جوانه گل و طول بساک معنی دار است (p<0.0001، r=0.8). در بررسی های سیتولوژیکی مشخص شد که مسیر طبیعی نمو میکروسپور در گوجه فرنگی شامل سه فاز تقسیم میوز تا تشکیل تتراد، تفکیک تترادها و بلوغ میکروسپور به دانه گرده است که میکروسپورها در هر مرحله از لحاظ اندازه و خصوصیات مورفولوژیکی با هم متفاوت هستند. بیشترین فراوانی میکروسپورهای مرحله میوز تا اواسط مرحله میکروسپورهای تک هسته ای در جوانه های با طول 4.9-4 میلی متر مشاهده شد. بنابراین از این نتایج می توان برای تعیین زمان مناسب برداشت جوانه های گل در مطالعات القاء آندروژنز جهت انحراف میسر نمو طبیعی میکروسپورها به سمت مسیر اسپوروفیتی برای القاء کالوس یا القاء مستقیم جنین های هاپلوییدی بهره جست.

در این آزمایش 3 رقم کلزای بهاره گلوبال، پی اف و آپشن به عنوان مواد گیاهی انتخاب گردیدند. گیاهان دهنده میکروسپورها در اتاق رشدی با دمای 15.10 درجه سانتیگراد و دوره نوری 16.8 ساعت (شب / روز) قرار داده شدند. میکروسپورها در مرحله تک هسته ای انتهایی تا ابتدای دو هسته ای از غنچه هایی به طول 2.5 تا 3.5 میلیمتر جدا شدند و در محیط کشت 13- NLN حاوی 13% ساکاروز کشت گردیدند. میکروسپورهای کشت شده به مدت 14 روز در معرض تنش دمایی 30 درجه سانتیگراد و در شرایط تاریکی قرار گرفتند و پس از آن به اتاق رشدی با دمای 25 درجه سانتیگراد و در داخل یک لرزاننده منتقل گردیدند. ارقام به لحاظ توان جنین زایی میکروسپورها دارای اختلاف معنی داری در سطح 1% بودند. مقایسه میانگین ها نشان داد که رقم پی اف و رقم آپشن به ترتیب با تولید 3412.25 و 3079.5 جنین، بیشترین تعداد جنین را تولید کردند.

در تحقیق حاضر، تعداد هشت رقم از گندم های هگزاپلویید تجاری ایران از نظر پاسخ به کشت میکروسپور مورد ارزیابی قرار گرفتند. پیش تیمار سنبله ها با محرک های شیمیایی القا کننده جنین زایی (شامل 2- هیدروکسی نیکوتینیک اسید، (BAP, 2, 4-D در دمای 33°C به مدت 72-48 ساعت اعمال شد. جداسازی میکروسپورها با روش آسیاب کردن سنبله ها در محلول جداسازی میکروسپورها 0.3 mol L-1) مانیتول) انجام گرفت. سپس، کشت توام میکروسپورها با چند عدد تخمدان تازه گندم در محیط کشت مایع NPB99، با تراکم 4×103 میکروسپور در هر میلی لیتر، در پتری دیش های یکبار مصرف (60×15mm) و در شرایط 27°C و تاریکی انجام شد. 4-3 هفته پس از کشت، میزان پاسخ ارقام گندم مورد مطالعه به کشت میکروسپور ارزیابی گردید. بررسی های سیتولوژیکی با استفاده از میکروسکوپ معکوس نشان داد که ساختارهای چند سلولی، تقریبا یک هفته بعد از کشت تشکیل می گردند. در طول هفته دوم، دیواره میکروسپورها شکافته شده و جنین نارس جوانه می زنند. رشد و بلوغ این جنین ها، در طی 10 تا 14 روز بعد انجام می گیرد. بر اساس نتایج تجزیه واریانس، تفاوت های معنی داری از نظر میزان تشکیل جنین، بین ارقام وجود داشت که این امر نشان دهنده وابستگی ژنتیکی این صفت می باشد. ارقام گندم فلات و مغان 1 به ترتیب با میانگین تولید 81.58±1427 و 54.55±1108 جنین در واحد سنبله، به عنوان ژنوتیپ های برتر از نظر جنین زایی شناسایی شدند.

استفاده از روش هاپلوئیدهای مضاعف شده می تواند برای اهداف اصلاحی از جمله کاهش طول دوره اصلاحی کاربرد داشته باشد. در تحقیق حاضر تاثیر تیمار نوری بر جنین زایی از کشت میکروسپورها در سه رقم کلزا؛ گلوبال، اپشن و پی اف و همچنین باززایی گیاهچه ها از جنین های حاصله در طی دو آزمایش جداگانه مورد مطالعه قرار گرفت. در آزمایش اول میزان جنین زایی میکروسپورها در محیط کشت NLN-13 تحت تاثیر سه تیمار نوری شامل تاریکی مطلق، 16 ساعت نور و 8 ساعت تاریکی و تناوب یک روز تاریکی و یک روز 16 ساعت نور و 8 ساعت تاریکی به صورت آزمایش فاکتوریل در قالب طرح پایه کاملا تصادفی با 5 تکرار مطالعه شد. نتایج حاکی از معنی دار شدن اثر رقم، تیمار نوری و همچنین اثر متقابل بین دو فاکتور بود. تیمار تاریکی در دو رقم گلوبال و پی اف تاثیر معنی داری بر روی میزان جنین زایی داشت و سبب افزایش معنی دار میزان جنین زایی در مقایسه با دو تیمار دیگر شده است و در این دو رقم، میزان جنین زایی در تیمار تاریکی در گروه a قرار گرفت. اما در رقم اپشن سه تیمار نوری تفاوت معنی داری با همدیگر ندارند و نشان می دهد که در این رقم جنین زایی تحت تاثیر تیمار نوری قرار نگرفته است. در آزمایش دوم نیز میزان باززایی گیاه از جنین های حاصل از کشت میکروسپور به صورت آزمایش فاکتوریل در قالب طرح پایه کاملا تصادفی دو فاکتوره با 10 تکرار مطالعه شد. رقم شامل گلوبال، اپشن و پی اف فاکتور اول و جنین های بدست آمده در شرایط تاریکی و 16 ساعت نور و 8 ساعت تاریکی فاکتور دوم را تشکیل دادند. نتایج حاکی از آن است که فقط اثر رقم بر روی میزان باززایی گیاهچه ها معنی دار بود. نتایج همچنین نشان داد که رقم پی اف بیشترین تعداد گیاهچه های باززایی شده را داشت و در گروه a قرار گرفت.

برخی عوامل موثر بر جنین زایی در کشت میکروسپورهای جداشده کلزا و باززایی گیاهچه ها از جنین های حاصله در آزمایش هایی جداگانه بررسی شدند. آزمایش ها به صورت فاکتوریل دو فاکتوره و در قالب طرح پایه کاملا تصادفی انجام شدند. در تمام آزمایش ها، ارقام در سه سطح شامل گلوبال (Global)، اپشن (Option) و پی اف (PF7045/91) فاکتور اول را تشکیل می دادند. میکروسپورها از غنچه های به طول 4-3 میلی متر جدا و در محیط کشت NLN-13 کشت شدند. میکروسپورهای کشت شده به مدت 14 روز در معرض تنش دمایی 30 درجه سانتی گراد و در شرایط تاریکی قرار گرفتند و پس از آن به اتاق رشدی با دمای 25 درجه سانتی گراد و در داخل یک لرزاننده منتقل گردیدند. برای باززایی، جنین های 35-25 روزه به محیط کشت جامد B5 منتقل شدند و بعد از حدود 20 تا 25 روز، گیاهچه های طبیعی، گیاهچه های غیر طبیعی، جنین های ریشه دار و جنین های تغییر نکرده شمارش شدند. در آزمایش اول جنین زایی اثر حجم محیط کشت، رقم و نیز اثرمتقابل آنها معنی دار بود. در رقم گلوبال، حجم 12.5 میلی لیتر محیط کشت با متوسط تولید 695.5 جنین در هر پتری دیش، بیشترین میزان جنین زایی را داشت. در آزمایش دوم جنین زایی، اثر زغال فعال و اثرمتقابل دو فاکتور معنی دار بود. در آزمایش سوم جنین زایی منابع مختلف هیدرات کربن با هم اختلاف معنی دار داشتند. در آزمایش اول باززایی، اسید جیبرلیک اثر معنی دار بر تعداد جنین های تغییرنکرده، گیاهچه های غیرطبیعی، گیاهچه های طبیعی و جنین های ریشه دار داشت و اثرمتقابل اسید جیبرلیک و رقم بر گیاهچه های طبیعی معنی دار بود. در آزمایش دوم باززایی، اثرمتقابل عامل ژلی و رقم بر گیاهچه های طبیعی معنی دار بود.