ژنتیک نوین
سال:1390 | دوره:6 | شماره:1 |تعداد مقالات:11

تنش های غیر زنده از عوامل مهم کاهش محصولات زراعی هستند. گیاهان با توجه به اینکه قدرت جا به جایی ندارند، در شرایط تنش، پاسخ های متعددی در سطوح مولکولی، بیوشیمیایی و فیزیولوژیکی بروز داده و بدین وسیله ثبات خود را حفظ می کنند. پروتیین های شوک حرارتی از مهمترین پاسخ های گیاه در مواجه با تنش های غیر زنده می باشد که علاوه بر ایفای نقش در تاخوردگی، سرهم بندی، مکان یابی و تخریب پروتیین ها در فرایندهای طبیعی سلول، می توانند تحت شرایط تنش نیز در حمایت از گیاهان سبب حفظ هومئوستازی سلولی شوند. علاوه بر این، پروتیین های شوک حرارتی با سایر مکانیزم های پاسخ به تنش (مثل اسمولیت ها) نیز تقابل دارند. هدف از این مقاله، بررسی نقش پروتیین های شوک حرارتی و اجزای آنها در تنش های محیطی و تقابل آن با سایر مکانیزم های پاسخ به تنش می باشد.

ویروس های Y (PVY)، X (PVX)، S (PVS) و پیچیدگی برگ (PLRV) سیب زمینی از مهمترین ویروس های بیمارگر سیب زمینی به شمار می روند و به طور جدی باعث کاهش میزان و کیفیت محصول سیب زمینی می شوند. وقوع ویروس های یاد شده از اکثر مناطق اصلی کشت سیب زمینی در ایران نیز گزارش شده است. از این رو معرفی یک شیوه دقیق، سریع و ارزان برای ردیابی ویروس های یاد شده در مزارع تولید غده های بذری می تواند نقش مهمی در کنترل انتشار و خسارت آنها داشته باشد. در این پژوهش، روش Multiplex RT-PCR برای ردیابی همزمان ویروس های Y، X، S، پیچیدگی برگ سیب زمینی و ژن 18S rRNA به عنوان کنترل داخلی استفاده شد. سپس حساسیت این روش با آزمون سرولوژیکی الایزا که شیوه ای رایج برای ردیابی ویروس های سیب زمینی است، مقایسه گردید. ابتدا،RNA  کل از برگ گیاهان سیب زمینی آلوده به ویروس استخراج و سپس DNA مکمل برای ویروس های یاد شده و ژن 18S rRNA با استفاده از آغازگرهای اختصاصی معکوس به صورت جداگانه ساخته شد و واکنش RT-PCR برای هر کدام از ویروس ها و ژن 18S rRNA انجام گرفت. سپس واکنش Multiplex RT-PCR با استفاده از پنج جفت آغازگر انجام شد. در نهایت، پنج قطعه متفاوت (145-342 جفت باز) که اختصاصی ویروس ها و کنترل داخلی بودند به طور همزمان تکثیر شد و بر اساس وزن مولکولی آنها تشخیص داده شدند. همچنین حساسیت روش بهینه سازی شدهMultiplex RT-PCR  و Duplex RT-PCR در این مطالعه با روش تجاری DAS-ELISA در ردیابی ویروس های سیب زمینی مقایسه گردید. نتایج این پژوهش نشان داد که حساسیت Multiplex RT-PCR صد برابر بیشتر از آزمون الایزا در ردیابی ویروس های Y، S و پیچیدگی برگ سیب زمینی و حساسیت Duplex RT-PCR هزار برابر بیشتر از آزمون الایزا در ردیابی ویروس Y سیب زمینی بود.

ویروس نوارک ایرانی گندم (Iranian wheat stripe virus, IWSV) عضو غیر قطعی جنس تنوئی ویروس (Tenuivirus) است. از مهمترین پروتئین های کد شونده توسط تنوئی ویروس ها، پروتئین پوششی (CP) و پروتئین عمده غیرساختمانی (NS4) می باشند و آنتی بادی های تهیه شده بر علیه آنها می توانند برای ردیابی ویروس در طبیعت و بررسی وظایف این ژن ها مورد استفاده قرار گیرند. تهیه آموده خالص این پروتئین ها از گیاه مبتلا اغلب با اشکال روبرو است. در این مطالعه به منظور بیان ژن های cp و ns4 ویروس فوق، هر کدام از این دو ژن با استفاده از آغازگرهای اختصاصی تکثیر و پس از همسانه سازی به ناقل pET 28a انتقال داده شد. پلاسمیدهای نوترکیب در تراریختی باکتری E. coli سویه BL21 (DE3) استفاده گردید و سلولهای باکتری نوترکیب در محیط کشت حاوی IPTG جهت القا بیان ژنهای هدف کشت شدند. پس از القای بیان، پروتئین های ساخته شده به منظور شناسائی، استخراج شدند. نتایج حاصل از الکتروفورز SDS-PAGE دو نوار را با وزن مولکولی 40.9 و 23 کیلودالتون نشان داد که منطبق با وزن مولکولی محصولات بالقوه ای است که توسط دو ژن مزبور در دیگر تنوئی ویروس ها تولید می شوند. آنالیز وسترن بلات بیان پروتئین های CP و NS4 را با استفاده از آنتی بادی پلی کلونال اختصاصی تائید نمود. چنین پروتئین هائی در مقیاس وسیع و با خلوص زیاد می توانند در سیستم میکروبی تولید شوند و برای تهیه آنتی بادی های اختصاصی مورد استفاده قرار گیرند.

در این تحقیق ارتباط بین صفات زراعی و نشانگرهای مولکولی در جو با استفاده از 10 صفت زراعی و 70 نشانگر مولکولی حاصل از 10 جفت آغازگر ریزماهواره روی 115 ژنوتیپ بومی مورد مطالعه قرار گرفت. میزان محتوای اطلاعات چندشکلی آغازگرها بین 0.31 تا 0.85 متغیر بود. نشانگرهای AF220725A،Bmag0013  و HVM40 با بیشترین محتوای اطلاعات چندشکلی آغازگرها، بیشترین شاخص چندشکلی را نشان دادند، به این معنی که این نشانگرها بهتر از همه نشانگرهای استفاده شده توانستند فاصله ژنتیکی ارقام را مشخص کنند، در حالیکه نشانگرHVM70  با کمترین مقدار شاخص چندشکلی، به خوبی توانایی جداسازی ژنوتیپ ها را نداشته است. با استفاده از روش رگرسیون چندگانه (گام به گام) ارتباط بین هر کدام از 10 صفت زراعی و 70 نشانگر چندشکل مورد بررسی قرار گرفت. آغازگرهای HVM20، Gms003،Bmac0306  و HvHVA1 تغییرات بیشتری از صفات مورد بررسی را نشان دادند. نتایج نشان داد که برخی از نشانگرها با بیش از یک صفت ارتباط نشان می دهند که بیانگر این است که این صفات پیوستگی بسیار نزدیکی با همدیگر داشته و یا احتمالا تحت تاثیر ژن های چند اثره قرار دارند. برای درک این موضوع تهیه نسل های در حال تفرق و نقشه های پیوستگی ضروری می باشد.

دستورالعمل های زیادی برای نشانگرهای گوناگون توسعه یافته اند که سریع هستند و به مقادیر کمی DNA نیاز دارند. 120 گاو هلشتاین از 4 گله واقع در کرمان و 80 گاو بومی از 5 گله واقع در بم مورد آزمایش قرار گرفتند. هر دو آغازگر ISSR تست شده، به نام (AG)9C و (GA)9C باندهای متفاوت زیادی را تولید کردند. بر اساس نتایج این بررسی، نشانگرهای ISSR باندهای قابل مقایسه زیادی تولید می کنند، الگوهای انگشت نگاری ISSR قابلیت توارث بالایی دارند. چندشکلی ها در بین این 9 گله تست شده با این نشانگر آشکار بود، همچنین آغازگر(AG)9C  در مقایسه با آغازگر (GA)9C الگوهای بیشتر و مفیدتری را می دهد و مقایسه الگوهای ISSR به طور موفقیت آمیزی می تواند برای مطالعه تنوع بین و داخل جمعیت های گاو استفاده شود. میانگین تنوع ژنی برای نشانگر (AG)9C در گله های بومی و هلشتاین به ترتیب 0.57 و 0.28 و برای نشانگر (GA)9C به ترتیب 0.35 و 0.15 بود. میانگین تعداد جایگاه های چندشکل و میانگین درصد چندشکلی در هر جمعیت بر اساس نشانگر (AG)9C برای گله های بومی به ترتیب 15.60 و 44.65 و گله های هلشتاین 17.75 و 54.29 و بر اساس نشانگر (GA)9C برای گله های بومی به ترتیب 8.40 و 70.01 و گله های هلشتاین 10.25 و 85.42 به دست آمد. بالاترین درصد چندشکلی بر اساس نشانگر(AG)9C  در گله های هلشتاین به میزان %74.29 و در گله های بومی %65.71 و نشانگر (GA)9C در گله های هلشتاین به میزان 100% و در گله های بومی به میزان %91.7 بود. بنابراین، نشانگرهای ISSR انتخاب خوبی برای انگشت نگاری DNA گاو هستند.

تعداد 4 رقم پنبه به صورت یک طرح دای آلل یک طرفه با یکدیگر تلاقی داده شده و والدین و نتایج F1 آنها در قالب طرح بلوک های کامل تصادفی در 3 تکرار در دو آزمایش جداگانه (شرایط آبیاری بدون تنش و شرایط تنش خشکی) کشت گردیدند. تجزیه دای آلل برای صفات عملکرد وش، وزن وش قوزه، تعداد قوزه در بوته، درصد زودرسی و ارتفاع بوته بر مبنای روش 2 گریفینگ (مدل 2) انجام شد. در محیط بدون تنش واریانس ژنوتیپ ها برای ارتفاع بوته در سطح احتمال 1% و برای وزن وش قوزه در سطح احتمال 5% معنی دار بود. در حالی که در محیط تنش واریانس ژنوتیپ ها برای صفت عملکرد وش و ارتفاع بوته در سطح احتمال 5% معنی دار بود. اثرات ترکیب پذیری عمومی برای صفت وزن قوزه و ارتفاع بوته در محیط بدون تنش به ترتیب در سطح احتمال 1 و 5 درصد معنی دار شدند. همچنین این اثرات برای صفات عملکرد وش و ارتفاع بوته در محیط تنش به ترتیب در سطح احتمال 5 و 1 درصد معنی دار بودند. تجزیه دای آلل حاکی از وجود اثرات افزایشی ژن ها در کنترل صفات فوق بود. تجزیه دای آلل مرکب نشان داد که در کنترل ژنتیکی دو صفت عملکرد وش و ارتفاع بوته، واریانس ژنتیکی افزایشی اهمیت زیادی داشت. در شرایط تنش خشکی، وراثت پذیری خصوصی عملکرد وش بالا و در مورد ارتفاع بوته، در حدود متوسط بود.

در سال های اخیر علایم پوسته پوسته شدن تنه و نقش بلوطی برگ شبه پسوروزی بر روی درختان مرکبات در شهرستان گرگان مشاهده شده است. به منظور بررسی حضور ویروس پسوروز مرکبات، نمونه برداری هایی طی فصول مختلف سال 1385 و 1386 از باغات منطقه گرگان صورت گرفت. نمونه برداری از تمامی ارقام مرکبات منطقه شامل پرتقال (یافا، واشنگتن ناول، سان گین و تامسون) و نارنگی (کلمانتین) و از درختان مشکوک به آلودگی که دارای علایم بیماری پسوروز بودند، انجام گردید. آزمون سرولوژیک از طریق آزمون ساندویچ دو طرفه الیزا (DAS-ELISA) و با استفاده از کیت الیزای آنتی بادی منوکلونال ویروس پسوروز مرکبات (CPsV) و آزمون مولکولی RT-PCR با استفاده از پرایمرهای اختصاصی ویروس پسوروز مرکبات (CPV1 و CPV2) طراحی شده از ناحیه ژن پوشش پروتئینی ویروس پسوروز مرکبات بر روی 200 نمونه جمع آوری شده از باغات منطقه گرگان و 4 نمونه تهیه شده از گلخانه مرکز تحقیقات مرکبات (رامسر) که در آزمون بیولوژیک آلودگی آنها به ویروس پسوروز مرکبات به اثبات رسیده بود انجام پذیرفت. نتایج آزمون سرولوژیک در هیچکدام از نمونه ها موفق به ردیابی ویروس پسوروز مرکبات نشد. نتایج آزمون فوق الذکر در 7.5 درصد از نمونه های جمع آوری شده از باغات شهرستان گرگان و تمام نمونه های تهیه شده از گلخانه مرکز تحقیقات مرکبات (رامسر) پس از الکتروفورز محصولات PCR، در محدوده 600 جفت باز (مربوط به ویروس پسوروز مرکبات)، تولید باند کردند. نتایج این دو روش نشان دهنده عدم هماهنگی سرولوژیک ایزوله بومی ویروس پسوروز مرکبات با آنتی بادی منوکلونال تجارتی می باشد. در بررسی روش های استخراج ژنوم ویروس نیز استفاده از بافر گوانیدین تیوسیانات بهترین نتیجه را در میان بافرهای استخراج نشان داد. این اولین گزارش از وجود این ویروس بر روی درختان مرکبات در استان گلستان است.

برای کاهش اثر متقابل ژنوتیپ × محیط و انجام گزینش دقیق تر، عملکرد و پایداری ژنوتیپ ها را باید بطور همزمان مدنظر قرار داد. در این تحقیق از روش های پارامتری و ناپارامتری برای تعیین ژنوتیپ پایدار استفاده شد و سپس همبستگی بین این روش ها مورد بحث قرار گرفت. تعداد 10 ژنوتیپ عدس در 5 منطقه از ایران (گچساران، کرمانشاه، شیروان، گنبد و ایلام) بمدت 2 سال (1381-1382) مورد ارزیابی پایداری عملکرد قرار گرفتند. بر اساس نتایج تجزیه پایداری با استفاده از روش های پارامتری ضریب رگرسیون ابرهارت و راسل، میانگین مربعات درون مکانی لین و بینز، اکووالانس ریک و ضریب تبیین پینتوس به ترتیب ژنوتیپ های (9 و 6)، (9 و 5)، (8 و 9) و (9 و 8) را به عنوان پایدارترین ژنوتیپ ها معرفی کردند شناسایی شدند. بر اساس نتایج تجزیه روش های ناپارامتری آماره های NP1، NP2، NP3، Si (1)، Si (2) تنارازو و نصار و هان به ترتیب ژنوتیپ های (9 و 8)، (9 و 8 و 1)، (9 و 8)، (2 و 1) و (2 و 1) را به عنوان پایدارترین ژنوتیپ ها معرفی کرد شناسایی شدند. در نهایت با توجه به همبستگی بین روش های پارامتری و ناپارامتری ژنوتیپ شماره 9 (ILL 6199) به عنوان پایدارترین ژنوتیپ انتخاب شد. نتایج این تحقیق نشان داد اگر هدف، تعیین سازگاری عمومی باشد معیارهای پارامتری واریانس شوکلا، و میانگین مربعات لین و بینز و معیارهای ناپارامتری تنارازو و نصار و هان نسبت به سایر پارامترها مورد مطالعه در اولویت هستند.

تنش های محیطی مانند خشکی و شوری سبب کاهش تولید محصولات زراعی می شوند. آسیب ایجاد شده در اثر تنش شوری، شامل اختلال در عمل غشا پلاسمایی، افزایش میزان متابولیت های سمی، ممانعت از جذب مواد غذایی و فتوسنتز، ایجاد گونه فعال اکسیژن (ROS) و در نهایت مرگ سلول و گیاه است. در این تحقیق اثر شوری در ساعات اولیه تنش بر الگوی پروتئوم برگی گیاهچه های گندم (Triticum aestivum L.) مورد بررسی قرار گرفت. بذور دو رقم متحمل به شوری (رقم روشن) و حساس به شوری (رقم فلات) در گلخانه کشت شدند. در مرحله پنجه زنی، گیاهچه ها تحت تنش شوری با غلظت 100 و 200 میلی مولار کلرید سدیم قرار گرفتند و نمونه برداری 3، 6، 12 و 24 ساعت پس از اعمال تنش از برگ ها انجام شد. الگوی پروتئوم برگ گندم به وسیله تکنیک الکتروفورز دو بعدی بدست آمد. نتایج نشان داد که در رقم مقاوم به طور متوسط 86 لکه پروتئینی در مقایسه با شاهد تغییرات معنی داری داشتند که بیان 78 درصد پروتئین ها افزایش و 13.5 درصد کاهش یافت. در رقم حساس به طور متوسط 94 لکه پروتئینی تغییرات معنی داری داشته و در این رقم 25 درصد پروتئین ها افزایش بیان و 58.5 درصد کاهش بیان نشان دادند.

دفاع سیستمیک (SAR) از جمله دفاع هایی است که می تواند موجب ایجاد مقاومت گیاهان در برابر آلودگی ها سیستمیک ویروسی شود. در این بررسی کوشش به عمل آمد تا با استفاده از گیاه توتون سامسون (N. tabacum cv. Samsun NN) و نیز گیاه حساس توتون سامسون با بیان کم ژن RDR6، بیان فاکتورهای دفاعی درگیر در دفاع سیستمیک اکتسابی (SAR) در هنگام پاسخ فوق حساسیت پس از آلودگی با ویروس TMV و نیز در هنگام آلودگی سیستمیک با ویروس Y سیب زمینی (PVYo) مورد بررسی قرار گیرد. برای این منظور با استفاده از تکنیک Sq-RT-PCR میزان بیان کمی ژن های IVR، ERF5 و AOX1 سنجش شد. همچنین برای اولین بار میزان غلظت سالیسیلیک اسید در بافت ها با استفاده از باکتری گزارشگر سالیسیلیک اسید با نام Acinetobacter sp. ADP1 مورد سنجش قرار گرفت و امکان تولید پروتئین PR-1 در بافت ها با استفاده از آزمون وسترن بلات (Western Blot) ارزیابی گردید. نتایج حاکی از آن بود که واکنش دفاعی SAR می تواند در پاسخ به تنش های زیستی از جمله آلودگی سیستمیک ویروس PVYo در توتون فعال گردد ولی برای موثر بودن سیگنال سیستمیک کننده آن یعنی سالیسیلیک اسید اجزا ژنتیکی انتقال سیگنال باید بیان مناسبی داشته باشند و در زمان کمی بیان شوند و احتمالا ژن RDR6 می تواند یکی از اجزا ژنتیکی موجود در انتقال سیگنال مسیر SAR باشد. از آنجائی که تاکنون تک ژن های مقاومت برای ایجاد مقاومت در برابر ویروس PVYo کارآمد نبوده اند، بنابراین مقاومت های افقی چند ژنی با فراهم آوردن مقاومت های سیستمیک مانند SAR می توانند برای کنترل این بیماری ویروسی مورد استفاده قرار گیرند.