مجله بیوتکنولوژی ایران
سال:1387 | دوره:6 | شماره:4 |تعداد مقالات:7

ویروس پیچیدگی زردبرگ گوجه فرنگی زراعی (TYLCV) از ویروس های مهم گوجه فرنگی در مناطق گرمسیر و نیمه گرمسیر به شمار می رود. در این بررسی واکنش 134 نمونه ژنتیکی گوجه فرنگی زراعی (Solanum lycopersicum) و شش نمونه ژنتیکی از گونه غیر زراعی آن (Solanum peruvianum) در برابر جدایه ایرانی این ویروس TYLCV-Ir2 مورد مطالعه قرار گرفت. آلوده سازی گیاهان با استفاده از مگس سفید (Bemesia tabaci) انجام گردید و مقاومت آنها بر اساس علایم بیماری و یا تکثیر DNA ویروس ارزیابی شد. همه نمونه های ژنتیکی گوجه فرنگی زراعی سطوح متفاوتی از علایم بیماری را نشان دادند، در حالیکه هر شش نمونه ژنتیکی خویشاوند غیر زراعی آن (S. Peruvianam) مقاوم و بدون علایم بودند. ارزیابی فنوتیپی آلودگی با تکثیر یک قطعه DNA ویروس به اندازه 670bp در همه نمونه های ژنتیکی گونه زراعی مورد تایید قرار گرفت. اگر چه بر اساس دو آزمون فنوتیپی و مولکولی هیچ یک از نمونه های ژنتیکی گونه زراعی مقاومت کامل نشان ندادند، ولی 9 نمونه ژنتیکی متحمل به TYLCV شناسایی شدند. مقاومت بالایی که در نمونه های ژنتیکی S. peruvianum آلوده شده با مگس سفید دیده می شد، در نمونه های آلوده شده با پیوند مشاهده نمی گردید. به طوری که قطعه DNA تکثیر شده از TYLCV پس از پنج هفته در گیاهانی که از طریق پیوند آلوده می شدند، قابل تشخیص می شد. این نتایج نشان می دهد که احتمالا نمونه های ژنتیکی S. peruvianum تنها به انتقال ویروس توسط حشره مقاوم باشند.

در این پژوهش، ابتدا از طریق کشت میکروسپور، رویان های هاپلوئید تولید شدند و سپس از این رویان ها برای بررسی بیان موقت ژن uidA از طریق بمباران ذره ای استفاده شد. با استفاده از دستگاه PDS-1000/He، پارامترهای فیزیکی شامل فشار دیسک شکننده (900، 1100 و 1350 (psi، فاصله صفحه متوقف کننده تا بافت هدف (6 و 9 سانتیمتر)، اندازه ذرات طلا (0.6، 1 و 1.6 میکرومتر)، غلظت DNA و ذرات طلا (0.5 میکروگرم DNA همراه با 150 میکروگرم ذرات طلا یا 1 میکروگرم DNA همراه با 300 میکروگرم ذرات طلا درهر بمباران)، و تعداد بمباران (2|x, 1|x) بررسی شدند. همچنین اثر استفاده از عامل اسمتیک در محیط کشت (0.3 مول مانیتول و 0.4 مول مالتوز) و سن رویان های مورد استفاده بررسی شدند. تعداد نقاط آبی روی رویان ها بعد از هر بمباران شمارش شده و اثر پارامترهای مختلف مورد مطالعه روی کارایی بیان موقت GUS تعیین شد. بهترین بیان موقت ژن روی رویان های بدست آمده از کشت میکروسپور با استفاده از شرایط ذیل بدست آمد: دو مرتبه بمباران با دیسک شکننده psi، 1350 فاصله 9 سانتیمتر بافت هدف تا صفحه متوقف کننده، استفاده از ذرات طلا با اندازه 1 میکرومتر، استفاده از 1 میکروگرم DNA همراه با 300 میکروگرم ذره طلا در هر بمباران و پیش تیمار اسمتیک رویان های 4 تا 6 هفته ای با 0.4 مول مالتوز به مدت 6 ساعت قبل و 16 ساعت بعد از بمباران.

در این تحقیق یک نوع ایزوله باسیلوس GUSI گرمادوست از نمونه خاک باغ مرکبات جداسازی گردید. سه نوع آنزیم پروتئاز با استفاده از روشهای الکتروفورز پلی اکریل آمید حاوی سدیم دودسیل سولفات (SDS-PAGE) توسط آنالیز ریموگرام مورد شناسایی قرار گرفتند. این آنزیم ها در محدوده pH قلیایی (12-8) پایدار بوده و به ترتیب دارای دما و محدوده pH بهینه 70 درجه سانتیگراد و 12-6 می باشند. همچنین این پروتئازها دردمای 70 درجه سانتیگراد به طور قابل ملاحظه ای پایدارند. پس از 60 دقیقه انکوبه شدن در دمای 70 درجه سانتیگراد آنزیم ها 100% فعالیت اولیه خود را حفظ کرده اند. این آنزیم ها عمدتا توسط فنیل متیل سولفونیل فلوراید (PMSF) مهار می شوند در حالیکه در حضور 2- مرکاپتواتانول و یدواستامید حدود 80-90% فعالیت آنزیم حفظ می گردد. بعلاوه، اضافه نمودن SDS و EDTA تاثیرات ناچیزی روی فعالیت پروتئازی ندارد و افزودن Ca2+ به آن منجر به هیچگونه تغییری در فعالیت آنزیم نمی شود. این نتایج حاکی از آن است که این پروتئازها عمدتا متالوپروتئاز نیستند بلکه سرین پروتئازهای قلیایی غیر وابسته به کلسیم هستند.

انتروویروس ها عامل بوجود آورنده تعدادی از بیماریها در انسان می باشند. گروه B کوکساکی ویروس ها شایع ترین عوامل مسوول بیماری قلبی در انسان می باشد. اطلاعات ژنتیکی بدست آمده از انتروویروس ها اجازه توسعه روش های مولکولی جدیدی از قبیل NASBA (تکثیر بر اساس ترادف اسیدهای نوکلئیک) را برای شناسایی این ویروس ها، می دهد. در این مطالعه، کوکساکی ویروس B3 در کشت سلولی آلوده شده به ویروس و نمونه های بافتی بدست آمده از موشهای آلوده شده به ویروس، با استفاده از پرایمرهای اختصاصی و بوسیله تکنیکهای RT-PCR (نسخه بردای معکوس - واکنش زنجیره ای پلیمراز) و NASBA، شناسایی گردید. بر اساس نتایج، هر دو تکنیک برای شناسایی ویروس در کشت سلولی آلوده و نمونه های بافتی بدست آمده از حیوان آلوده، استفاده گردید. واکنش NASBA برای انجام، ساده تر از RT-PCR بود. غلظت KCl تنها فاکتور متغیر برای بهینه سازی واکنش NASBA بود. غلظت بهینه KCl برای انجام واکنش در حدود 90mM تعیین گردید. رقتهای سریال تهیه شده از غلظت 1 میکروگرم از RNA کل استخراج شده از سلول های آلوده به ویروس، نشان داد که هر دو تکنیک ویروس را تا رقت 10-5 شناسایی می کنند. نتایج حاصل از بررسی نمونه های بافت قلب و طحال بدست آمده از حیوان آلوده برای شناسایی ویروس با هر دو تکنیک، مثبت بود. در بحث، تکنیک NASBA نسبت به RT-PCR دارای مزایای متعددی بود و نشان داد که تکنیک جایگزین مناسبی برای تشخیص با حساسیت بالای کوکساکی ویروس B3 در نمونه های آلوده می باشد.

فاکتور محرکه کلنی گرانولوسیت انسانی (hG-CSF)، عاملی جهت تحریک رشد و تمایز سلول های پیش ساز گرانولوسیتی می باشد. امروزه این فاکتور گلیکوپروتئینی جهت درمان نوتروپنی و در موارد پیوند مغز استخوان کاربرد دارد. تاکنون محققین مختلفی در جهت ارتقای فعالیت زیستی و پایداری آن تلاش نموده اند. در این مطالعه، تکنیک جهش زایی هدفدار بر پایه واکنش زنجیره ای پلیمراز بر روی cDNA این فاکتور انجام پذیرفت. قطعه DNA بدست آمده در پلاسمید pBluescript SK(-) کلون شده و پس از توالی یابی و تایید جهش های مورد نظر، مجددا در ناقل pET-21a(+) کلون شده و در باکتری Escherichia coli BL21 بیان گردید. محصول بیان G-CSF جهش یافته نیز با روش های الکتروفورز در ژل پلی آکریلامید در حضور سدیم دودسیل سولفات (SDS-PAGE) و Western-blot بررسی گردید. نتایج بدست آمده نشان می دهند که G-CSF جهش یافته نوترکیب با موفقیت در سیستم پروکاریوتی کلون و بیان شده است. هدف از این تحقیق تولید پروتئین نوترکیب جدیدی است که انتظار می رود خصوصیات بیولوژیک ارتقا یافته ای نسبت به فرم طبیعی hG-CSF داشته باشد. بررسی عملکرد و اختصاصات زیست شناختی آن در مطالعات بعدی انجام خواهند شد.

در این تحقیق ژنوم کامل M2 سوش واکسینال ویروس آنفلوانزای مرغی جدا گردید و مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. ابتدا توتال RNA از سلولهای آلوده به ویروس آنفلوانزای مرغی جدا گردید و سپس به وسیله تکنیک مولکولی RT-PCR در دو مرحله از پرایمرهای Random Hexamer جهت ساخت cDNA و از پرایمرهای اختصاصی ناحیه مورد نظر جهت تکثیر ژنوم کامل ژن M2 استفاده گردید. قطعه مورد نظر بطول حدود 294-bp به کمک تکنیک مولکولی PCR تکثیر و سپس تعیین توالی گردید. مقایسه توالی این ژن با توالی های ثبت شده از این ژن در بانک جهانی اطلاعات ژنی نشان داد که این ژن در بین تمام ایزوله های از زیر تایپهای H9 و H5 از ویروس آنفلوانزای مرغی تشابه بسیار بالایی (92% تا 100%) دارد و قسمت خارج غشایی این پروتئین که در تحریک سیستم ایمنی نقش دارد در زیر تایپهای H5 و H9 از ویروس آنفلوانزای A در میزبانهای مختلف تشابه 97% تا 100% دارد.