مجله بیوتکنولوژی کشاورزی
سال:1397 | دوره:10 | شماره:1 |تعداد مقالات:9

فاکتور رشد فیبروبلاستی بازی انسانی (bFGF) یک پروتئین بسیار با ارزش با کاربردهای گسترده درمانی و تحقیقاتی است. در حال حاضر تولید این فاکتور رشد بشکل نوترکیب در بسترهای مرسوم میکروبی و سلول های حشرات با مشکلاتی همراه است که منجر به هزینه تولید بالا و در نتیجه محدود ساختن کاربرد آن شده است. کشت سلولی گیاه برنج بستری کارامد، ایمن و کم هزینه برای تولید پروتئین نوترکیب است. هدف از این تحقیق تهیه یک سازه بیانی مناسب برای بیان بالای نسخه بهینه سازی شده ای از فاکتور رشد انسانی bFGF در کشت سلولی گیاه برنج تحت کنترل عوامل تنظیمی ژن ramy3D بوده است. برای این منظور ابتدا توالی کدکننده فاکتور bFGF بر اساس شاخص های کاربرد کدونی و محتوای GC برای بیان در گیاه برنج بهینه سازی و در ادامه سنتز شد. بدنبال فرایند بهینه سازی، شاخص سازگاری کدونی از 76/0 به 82/0 و محتوای GC از 65/52 درصد به 45/55 درصد ارتقا یافت. توالی های تنظیم کننده ژن ramy3D برنج در قالب دو قطعه مجزا از روی DNA ژنومی تکثیر و همسانه سازی شدند. در ادامه اقدام به سرهم سازی توالی های تنظیم کننده ژن ramy3D در ناقل دوتایی گیاهی pCAMBIA1304 و سپس درج توالی کدکننده بهینه سازی شده ی bFGF در حدفاصل توالی پپتید راهنما و 3′ UTR شد. از جمله مزیت های سیستم بیانی Ramy3D می توان به میزان بیان بالای ژن انتقالی، القاپذیر بودن و همچنین سهولت تخلیص پروتئین بواسطه ترشح به محیط اشاره کرد.

با توجه به افزایش جمعیت جهان، امروزه تقاضا برای تولید پروتئین های نوترکیب در بافت های گیاهی در حال افزایش است. ریشه های موئین بخاطر زیست توده و ثبات ژنتیکی بالا به عنوان بافت هدفی مناسب مدنظر می باشند. گلیکوپروتئین تنظیمی BMP2، به عنوان یکی از مهمترین فاکتورهای رشد با کاربرد درمانی و تحقیقاتی در مهندسی بافت مطرح می باشد. انتخاب میزبان گیاهی مناسب، بافت مطلوب و سازه ژنی مناسب، از عوامل مهم در بالا بردن میزان تولید پروتئین نوترکیب است. در راستای حصول این هدف، در مطالعه حاضر تولید پروتئین نوترکیبBMP2 در ریشه های مویینه تراریخت گیاهان توتون و کلزا مورد بررسی قرار گرفت. برای تهیه سازه ژنی، در بالادست ژن BMP2، توالی هایUTR) TMV (5′ و KOZAK جهت افزایش بیان و در پایین دست ژن، توالی شش تایی هیستیدینی جهت تخلیص پروتئین و توالیKDEL بعنوان سیگنال نگهدارنده پروتئین درشبکه اندوپلاسمی تعبیه شدند. این توالی ژنی تحت کنترل پیشبرنده CaMV 35Sبیان شد. برای انتقال سازه ژنی مذکور به ریز نمونه های برگی توتون یک ماهه به عنوان گیاه مدل و انتهای کوتیلدونی کلزا شش روزه به عنوان یک گیاه زراعی از باکتری Agrobactrium rhizogenes استفاده گردید. پس از رشد ریشه های موئین و غربالگری آن ها به روش PCR، تایید درسطح رونویسی با روش RT-PCR انجام گرفت. در عین حال، تایید بیان پروتئین نوترکیب در میزبان با روش های آزمون الایزا و لکه گذاری وسترن صورت پذیرفت. نتایج این تحقیق بیان گر کارایی بالای سیستم ریشه های مویینه برای تولید فاکتورهای نوترکیب درمانی می باشد، که استفاده از آنها را در رآکتورهای زیستی مطرح می سازد.

بیماری شانکر باکتریایی مرکبات توسط باکتری Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) ایجاد می شود. سیستم ترشحی نوع سه این باکتری دارای یک ساختار خارج سلولی رشته ای است که پروتئین های باکتریایی را به داخل سلول گیاه وارد می کند. پروتئین پیلین (HrpE) جزء اصلی تشکیل دهنده پیلوس می باشد که توسط ژن HrpE کد می شود. تولید پادتن اختصاصی علیه پروتئین پیلین می تواند به منظور شناسایی گیاهان آلوده و همچنین به عنوان منبع ژنتیکی مقاومت علیه بیماری مورد استفاده قرار گیرد. غیر فعال سازی پروتئین HrpE با استفاده از پادتن می تواند منجر به سرکوب بیماری در گیاه شود. هدف از این تحقیق جداسازی و بیان ژن HrpE و خالص سازی پروتئین حاصل از آن بود. برای این منظور، قطعه ژنی HrpE با استفاده از آغازگرهای اختصاصی جدا و در ناقل pTZ57R/T همسانه سازی شد. بیان این ژن به صورت نوترکیب در ناقل pET28a(+) و در سویه Rosetta باکتری Escherchia coli انجام شد. بهینه سازی تولید پروتئین نوترکیب تحت تاثیر زمان های مختلف، دمای نگهداری و همچنین غلظت های مختلف القا کننده مورد بررسی قرار گرفت. بیشترین مقادیر بیان در دمای 30 درجه سلسیوس و طی زمان 16 ساعت و با IPTG یک میلی مولار به دست آمد. خالص سازی پروتئین نوترکیب HrpE با استفاده از روش کروماتوگرافی تمایلی بر روی ستون نیکل صورت پذیرفت. نتایج آزمون های الکتروفورز پروتئین و وسترن بلاتینگ با استفاده از پادتن های اختصاصی، صحت بیان و خالص سازی پروتئین نوترکیب پیلین را مورد تایید قرار دادند. پروتئین نوترکیب تولید شده می تواند به عنوان آنتی ژن برای تولید پادتن های تخصصی تک همسانه ای و چند همسانه ای مورد استفاده قرار گیرد.

بیماری لکه برگی سپتوریایی گندم (STB) با عامل Zymoseptoria tritici یکی از مهم ترین بیماری های گندم در جهان و ایران به شمار می رود. مقاومت ژنتیکی مهم ترین و اقتصادی ترین روش برای کنترل این بیماری می باشد. بنابراین شناسایی منابع مقاومت جدید در ژنوتیپ های گندم برای کنترل این بیماری ضروریست. در این پژوهش، واکنش 33 ژنوتیپ گندم نان در برابر پنج جدایه از قارچ Z. tritici در مرحله گیاهچه ای مورد بررسی قرار گرفتند. از بین ژنوتیپ های مورد بررسی، 11 ژنوتیپ در برابر یک یا چند جدایه مقاومت نشان دادند. از بین این ها سه ژنوتیپ نوگال، آرتا و N-92-9 مقاومت بیشتری به تمام جدایه های مورد بررسی داشتند که نشان می دهد این ژنوتیپ ها دارای ژن های مقاومت موثر می باشند و می توانند به عنوان منابع مقاومت به STB در برنامه های اصلاح ارقام گندم به کار روند. هفت ژنوتیپ در برابر یک یا چند جدایه نیمه مقاوم بودند و سایر ژنوتیپ ها در برابر جدایه های مورد بررسی حساسیت نشان دادند. پنج جدایه ی مورد بررسی در این پژوهش دارای درجات مختلفی از پرآزاری و تهاجم روی ژنوتیپ های گندم بودند که این امر بیانگر وجود تفاوت در ژن های ناپرآزاری این بیمارگر است. جدایه ی BK94 پرآزارترین و مهاجم ترین جدایه و جدایه ی BK56 کم ترین پرآزاری و قدرت تهاجمی را داشت.

به منظور مکان یابی QTL های اصلی و اپیستاتیک و اثر متقابل آنها با محیط برای عملکرد بیولوژیک، 148 لاین اینبرد نوترکیب گندم همراه با والدین YecoraRojo و No. 49 در دو ایستگاه تحقیقات کشاورزی میاندوآب و مهاباد در شرایط نرمال و تنش کم آبی انتهای فصل طی دو سال زراعی 1394 و 1393 مورد ارزیابی قرار گرفتند. نقشه پیوستگی مورد استفاده شامل 177 نشانگر ریز ماهواره و 51 نشانگر رتروترانسپوزون بود. برای تجزیه QTL از نرم افزار QTL Network. 2 استفاده شد. در تحقیق حاضر مقدار وراثت پذیری خصوصی برآوردشده برای عملکرد بیولوژیک در شرایط نرمال، تنش کم آبی و متوسط دو شرایط به ترتیب برابر 52/26، 91/26 و 09/16 درصد برآورد شد. همچنین بالاترین بازده ژنتیکی برای عملکرد بیولوژیک در شرایط نرمال دیده شد. نتایج تجزیه QTL نشان داد در شرایط نرمال یک QTL (46/2=R2A)، یک اثر متقابل QTL×E (46/5=R2AE)، دو اثر اپیستازی QTL×QTL (06/3=R2AA) و هفت اثر متقابل QTL× QTL×E (06/14=R2AAE) وجود داشت. در شرایط تنش کم آبی نیز یک QTL (8=R2A)، سه اثر اپیستازی QTL× QTL (04/2=R2AA) و هفت اثر QTL×QTL×E (74/24=R2AAE) مکان یابی شد، هم چنین در مجموع دو شرایط نیز دو QTL (7 =R2A)، سه اثر متقابل QTL×E با محیط (66/4=R2AE)، پنج اثر اپیستازی QTL× QTL و (68/4=R2AA)، هشت اثر QTL× QTL×E (20/24=R2AAE) معنی دار بودند. هر چند در مطالعه حاضر QTL های کمی برای عملکرد بیولوژیک مشاهده شد اما در هر سه شرایط مورد بررسی نقش کروموزوم 7B در کنترل عملکرد بیولوژیک چشم گیر بود به طوری که یک QTL پایدار در مجاورت نشانگرهای Cfa2174. 1-Wms573 مکان یابی شد که می تواند در گزینش به کمک مارکر در عملکرد بیولوژیک مورد استفاده قرار گیرد.

لاله واژگون گرگانی (Fritillaria raddeana Regel. ) متعلق به خانواده سوسن است. دارای ارزش زینتی-دارویی و مقاومت نسبی به خشکی و مناطق سنگلاخی می باشد. القای پلوییدی در شرایط درون شیشه ای به عنوان راهکاری برای ایجاد گیاهان زینتی با خصوصیات و اشکال جدید و هم چنین دستیابی به گیاهانی با مقاومت بیشتر به خشکی و دمای پایین، از اهمیت بسزایی برخوردار است که این امر از طریق دو برابر کردن کروموزوم ها امکان پذیر است. در این راستا از مواد و روش های متعددی استفاده می شود که ممکن است در مواردی نه تنها در برخی گونه ها پلی پلوییدی ایجاد نشود، بلکه نتیجه ای بر خلاف نتایج معمول نیز به دست آید. این مطالعه در ابتدا با هدف امکان ایجاد گیاهان پلی پلویید با استفاده از کلشی سین انجام شد. کالوس های حاصل از کشت اندام های مختلف F. raddeana در محیط حاوی غلظت های متفاوت کلشی سین (01/0، 05/0، 001/0، 005/0 درصد) به مدت زمان های 24، 48 و 72 ساعت بازکشت شدند. آزمایش به صورت فاکتوریل در قالب طرح کاملا تصادفی با سه تکرار انجام شد. به علت پایین بودن سرعت رشد گیاه، درصد زنده مانی تا دو ماه پس از اعمال تیمار محاسبه شد. شمارش کروموزوم های نوک ریشه، مطالعات روزنه ای و آزمایشات فلوسایتومتری جهت تایید یا رد افزایش سطح پلوییدی انجام گرفت. نتایج نشان داد در غلظت های بالاتر از 01/0 درصد و زمان تیمار بیشتر از 48 ساعت، درصد بالایی از کالو س ها یا گیاهچه های باززایی شده از بین رفتند و علی رغم افزایش در سرعت رشد و کاهش تعداد روزنه ها در غلظت 01/0 درصد کلشی سین، تعداد کروموزوم ها تغییری نکرد و القای پلوییدی در گیاهان تیمار شده مشاهده نشد.

به منظور شناسایی تنوع های تک نوکلئوتیدی Single nucleotide polymorphism)) در ژن های اوژنول O-متیل ترنسفراز (EOMT) و چاویکول O-متیل ترنسفراز (CVOMT) در توده های مختلف ریحان از نشانگرهای CAPS (Cleaved amplified polymorphic sequences) و توالی یابی استفاده شد. قطعاتی با اندازه 571 و 908 جفت باز از نواحی کد کننده این دو ژن تکثیر و با آنزیم های برشی Pst1 و MseI هضم شد. آنزیم Pst1 در ژن EOMT دو قطعه با اندازه های480 و 91 جفت باز و در ژن CVOMT قطعاتی با اندازه های 621 و 287 جفت باز تولید می کند. برش قطعات تکثیری هر دو ژن با آنزیم Pst1 الگوهای مشابهی در 80 فرد تولید کرد. آنزیم MseI در این دو ژن به ترتیب قطعاتی با اندازه های 59، 135 و 377 جفت باز و 275، 302 و 331 جفت باز تولید می کند. برش قطعات تکثیر شده هر دو ژن با این آنزیم در افراد مورد مطالعه الگوهای برشی متنوعی تولید کرد. از هر نوع الگوی برشی یک نمونه انتخاب و توالی یابی شد. توالی ها با استفاده از نرم افزار Clustal Omega هم ردیف و SNPها در هر کدام از ژن ها شناسایی شدند. نتایج همردیفی نشان داد جهش های همجنس TC و AG در ژن EOMT مشاهده می شود ولی جهش های ناهمجنس در این ژن مشاهده نشد. در ژن CVOMT تبدیل بازهای AG، TC، AC و AT شناسایی گردید که بیشترین جهش مربوط به تبدیل بازهای AG بود. به طورکلی نتایج این تحقیق نشان داد که چندشکلی در نواحی اگزونی ژن های مورد مطالعه کم بوده و نواحی کد کننده این ژنها در طول تکامل ریحان محفوظ بوده است.

انگور بیدانه قرمز یکی از ارقام مهم و با کیفیت انگور در ایران می باشد که در سال های اخیر توسط کشاورزان مورد استقبال زیادی قرار گرفته است. با توجه به اهمیت تکثیر انبوه این گیاه و تولید نهال های سالم و به ویژه عاری از سرطان مو، در پژوهش حاضر اثر غلظت های مختلف تیمارهای هورمونی بر پرآوری و ریشه زایی درون شیشه ای رقم بیدانه قرمز با هدف ارائه دستورالعملی مناسب جهت تکثیر درون شیشه ای آن مورد بررسی قرار گرفت. بدین منظور از محیط کشت MS حاوی غلظت های مختلف بنزیل آمینوپورین (BAP) (25/0، 50/0، 1 و 2 میلی گرم در لیتر) به همراه 2/0 میلی گرم در لیتر ایندول استیک اسید (IAA) برای پرآوری نمونه ها و از ایندول بوتیریک اسید (IBA) و نفتالین استیک اسید (NAA) در غلظت های 0، 8/0 و 6/1 میلی گرم در لیتر برای ریشه زایی نمونه ها در قالب طرح کاملاً تصادفی استفاده شد. نتایج نشان داد که هورمون-های مورد استفاده اثر معنی داری روی خصوصیاتی از قبیل تعداد گره، طول میانگره، تعداد شاخساره، طول و قطر شاخساره، وزن تر و خشک شاخساره، تعداد و سطح برگ، شاخص کلروفیل، تعداد و طول ریشه، وزن تر و خشک ریشه در ریزنمونه ها داشت. بین غلظت های مورد استفاده این هورمون ها نیز تفاوت وجود داشت. بر اساس نتایج، بیشترین پرآوری نمونه ها در غلظت 25/0 میلی گرم در لیتر BAP و بیشترین تأثیر بر میزان ریشه زایی در غلظت 8/0 میلی گرم در لیتر IBA به دست آمد. طبق این نتایج می توان از تیمارهای هورمونی مشخص شده جهت افزایش پرآوری و ریشه زایی درون شیشه ای در رقم بیدانه قرمز انگور استفاده نمود.

شناسایی تنوعات ساختاری مسئول تفاوتهای فنوتیپی در حیوانات اهلی از نظر اقتصادی اهمیت ویژه ای دارد. یکی از دقیق ترین و جدیدترین رویکردهای مورد استفاده در شناسایی این تنوعات، استفاده از تکنیک های توالی یابی نسل جدید است. در پژوهش حاضر، ژنوم مرغ بومی فارس به منظور شناسایی چندشکلی های تک نوکلئوتیدی و حذف و اضافه های کوتاه، با استفاده از داده های توالی یابی کل ژنوم مورد بررسی قرار گرفت. نمونه های مورد بررسی توسط سیستم توالی یابی شرکت ایلومینا (Hiseq 2000) مورد تعیین توالی قرار گرفت. پس از بررسی کیفیت داده ها توسط نرم افزار FastQC، همردیفی توالی های کوتاه با ژنوم مرجع با برنامه BWA انجام و سپس چند ریختی های تک نوکلئوتیدی و حذف و اضافه های کوچک به کمک برنامه GATK مشخص شدند. درصد همردیفی توالی های کوتاه با ژنوم مرجع بالای 99 درصد بود. در این مطالعه 8858153 چند ریختی تک نوکلئوتیدی و 895378 حذف و اضافه کوچک بدست آمد که کمترین مقدار آن در ناحیه اگزونی مشاهده شد. نتایج نشان داد چندریختی های تک نوکلئوتیدی هتروزیگوس فراوانی بیشتری نسبت به چند ریختی های هموزیگوس دارند که این نشان دهنده تنوع زیاد جمعیت مورد بررسی است. همچنین باتوجه به پیشینه چند هزارساله اهلی شدن مرغ در ایران، می توان انتظار داشت که تطابق پذیری با محیط در جمعیت مورد مطالعه اتفاق افتاده باشد و در نتیجه، تغییرات ژنومی در جهت سازگاری با محیط باعث ایجاد تنوع در جمعیت شده است.