پژوهش های آسیب شناسی زیستی
سال:1392 | دوره:16 | شماره:4 |تعداد مقالات:10

لطفا برای مشاهده چکیده به متن کامل (PDF) مراجعه فرمایید.

تعیین توالی DNA یکی از مهم ترین دستاوردهای بشر محسوب می شود. امروزه روش های متفاوتی به منظور تعیین توالی نوکلئوتیدها (آدنین، گوانین، سایتوزین و تیمین) در یک مولکول DNA به کار گرفته می شود. آشنایی با دانش تعیین توالی DNA از ارکان اجتناب ناپذیر پژوهش های مرتبط با علم زیست شناسی است و در گرایش های پژوهشی و کاربردی وسیعی مانند تشخیص بیماری ها، زیست فنآوری، زیست شناسی جنایی و زیست شناسی سیستماتیک استفاده می شود. امکان تعیین توالی DNA به طور چشمگیری پژوهش در زیست شناسی و کشفیات در این زمینه را سرعت بخشید. پس از ابداع روش های خودکار تعیین توالی با استفاده از فنآوری های پیشرفته، پروژه های بزرگی به واسطه همکاری های علمی بین المللی انجام شد که منجر به تعیین توالی کامل ژنوم انسان و بسیاری از حیوانات، گیاهان و میکروب ها شد.هدف اصلی نسل سوم فنآوری تعیین توالی، افزایش توان عملیاتی، کاهش هزینه ها، زمان و مواد مصرفی است. در این راستا امروزه دانشمندان در صدد طراحی یک میکروسکوپ ژنی هستند که در این سیستم با نشاندار کردن DNA پلیمراز، توالی ژنوم هنگام عبور از حفره های ریز با روش های میکروسکوپی خوانده می شود. با نشاندار کردن نوکلئوتید با اجزای سنگین تر مانند هالوژن ها، شرایطی فراهم می شود تا جایگاه نوکلئوتید ها در قطعات بزرگ تر از 5000 نوکلئوتید با چشم مشاهده و ثبت شود.از آن جا که پژوهشگران علم ژنتیک در ایران نیز از این فنآوری استفاده می نمایند و با توجه به نیاز به منابع فارسی قابل فهم در این زمینه، مولفان مقاله حاضر بر آن شدند تا به ترجمه و نگارش مجموعه ای از مقالات مروری در این زمینه بپردازند. مقاله حاضر اولین مقاله از این سری مقالات است که تنها به معرفی مختصر روش ها بسنده کرده است.

هدف: اسینتوباکتر بومانی یکی از پاتوژن های اصلی بیمارستانی است و ظرفیت بالایی برای مقاومت به انواع مواد ضد میکروبی موجود دارد. اسینتوباکتر بومانی انواع متفاوتی از عفونت ها شامل پنومونی، مننژیت و عفونت های مرتبط با خون را ایجاد می کند. پروتئین های مربوط به بیوفیلم (Bap) پروتئینی اختصاصی در سطح سلول است که مستقیما در تشکیل بیوفیلم در اسینتوباکتر بومانی مورد نیاز است و نقش اصلی را در عفونت زایی باکتری بازی می کند. در مطالعه قبلی محققان حاضر نواحی متعددی از این پروتئین بررسی شد و با در نظر گرفتن معیارهای مختلف، چند ناحیه به عنوان نواحی حفاظت شده و ایمنی زا معرفی و ایمنی زایی یکی از این نواحی مطالعه شد. این ناحیه به اسید های آمینه شماره 706- 1076 از پروتئین بالغ مربوط می شود که طی بیان این ناحیه و تزریق آن به موش میزان بالایی آنتی بادی تولید شد که از موش در برابر این باکتری محافظت می کرد. در مطالعه پیش رو، ایمنی زایی ناحیه معرفی شده دیگری (ناحیه 4) از پروتئین Bap بررسی می شود تا ضمن تایید مطالعات بیوانفورماتیکی قبلی میزان ایمنی زایی آن ارزیابی شود.مواد و روش ها: در مطالعه حاضر ژن ناحیه ای از پروتئینBap با 1620 جفت باز به وسیله واکنش زنجیره ای پلیمراز تکثیر و در pET32a کلون شد. این ناحیه از پروتئین بزرگ Bap با موفقیت بیان و توسط آنتی بادی های مونوکلونال تایید شد. در این پژوهش موش های BALB/c به وسیله تزریق زیرپوستی پروتئین نوترکیب خالص، ایمن شده و ایجاد آنتی بادی در بدن موش با استفاده از الایزا ارزیابی شد.نتایج: تیتر آنتی بادی تولید شده در سرم موش بالا بود که این امر بیانگر آنتی ژنسیته و ایمنی زایی بالای این پروتئین نوترکیب است.نتیجه گیری: نتایج نشان می دهد که این پروتئین می تواند گزینه مناسبی برای تولید یک واکسن جدید نوترکیب باشد.

هدف: مطالعه تغییرات فیزیولوژیک سلول های نوترکیب در مقایسه با سلول های والد، اطلاعات مفیدی برای بهبود کارآیی فرایند تولید فراهم می نماید. در این مطالعه تاثیر بیان IgG4 کایمریک علیه نشانگر CD33 بر رشد سلول Sp2.0 بررسی شده است.مواد و روش ها: ژن های نواحی متغیر زنجیره های سبک و سنگین آنتی بادی تولید شده توسط سلول M195 به ترتیب در ناقل های pFUSE-CLIg-hk و pFUSE-CHIg-hG4 همسانه سازی شد. پلاسمیدهای نوترکیب در دو مرحله با استفاده از لیپوفکتامین به سلول های Sp2.0 منتقل شد. سلول های پایدار در محیط حاوی آنتی بیوتیک های بلاستیسیدین و زئوسین انتخاب شدند. الحاق سازه نوترکیب به ژنوم سلول های تراریخت مقاوم به آنتی بیوتیک ها و همچنین بیان IgG4 با استفاده از روش های PCR، RT-PCR و وسترن بلات بررسی شد. برای مطالعه پارامترهای کینتیکی، سلول های والد و نوترکیب با چگالی 1´105 سلول در هر میلی لیتر محیط کشت در پلیت 12 خانه به مدت 9 روز انکوبه شدند و هر 24 ساعت از سلول ها نمونه برداری شد و شمارش تعداد سلول زنده و محاسبه درصد زنده بودن انجام گرفت.نتایج: بر اساس نتایج PCR، RT-PCR و وسترن بلات، ایجاد سلول تولید کننده پایدار IgG4 تایید شد. این مطالعه نشان داد که حداکثر چگالی سلولی برای سلول های نوترکیب در مقایسه با سلول های والد 46 درصد کاهش یافته است در حالی که در این نمونه ها درصد سلول های زنده تغییری نکرده است.نتیجه گیری: بر اساس نتایج این تحقیق بیان IgG4 کایمریک در سیستم Sp2.0/pFUSE-CHIg-hG4-pFUSE-CLIg-hk باعث تغییر برخی از پارامترهای رشدی سلول میزبان می شود.

هدف: یکی از حوزه های مهم در اپی ژنتیک، متیلاسیون DNA است که دی نوکلئوتیدهای CpG در ژنوم را تحت تاثیر قرار داده و رونویسی بیان ژن های مورد نظر را کنترل می کند. در ژنوم ویروس هپاتیت B، سه جزیره غنی از دی نوکلئوتید CpG وجود دارد که تمایل شدیدی به متیله شدن دارد. هدف از این مطالعه تعیین الگوی متیلاسیون ژن x ویروس هپاتیت B در بیماران مبتلا به این ویروس است.مواد و روش ها: جمعیت هدف بررسی در این مطالعه 45 بیمار مبتلا به ویروس هپاتیت B بود. ابتدا DNA ژنومی ویروس برای تعیین میزان متیلاسیون با بی سولفیت سدیم تیمار شد. سپس با دو گروه آغازگر متیله و غیر متیله توسط روش MSP تجزیه و تحلیل شد.نتایج: میزان متیلاسیون در نمونه های سرمی مبتلا به ویروس به طور کلی 35.5 درصد بود و این نرخ در بیماران HBeAg مثبت 20.8 درصد و در مبتلایان HBeAg منفی 52.3 بود. به این ترتیب میزان متیلاسیون در نمونه سرمی افراد مبتلابه هپاتیت B مزمن HBeAg منفی به طور معنی داری بیشتر از میزان متیلاسیون DNA ویروس در افراد مبتلا HBeAg مثبت است که این فرضیه با Student T-test با P=0.02 تایید شد.نتیجه گیری: متیلاسیون ژنوم هپاتیت B می تواند به عنوان یک مکانیسم جدید برای کنترل پیشرفت عفونت ویروسی و همچنین تعیین مرحله بالینی بیماری مبتلا در نظر گرفته شود، بنابراین دانستن الگو های مختلف متیلاسیون DNA از اهمیت ویژه ای برخوردار است. در این مطالعه میزان متیلاسیون در بیماران HBeAg منفی به طور معنی داری بالاتر از افراد HBeAg مثبت تعیین شد (P=0.02).

هدف: هدف از این مطالعه ارزیابی وقوع مرگ سلولی برنامه ریزی شده (آپوپتوز) در بافت تخمدان انسانی انجماد شیشه ای شده در مقایسه با گروه کنترل به وسیله مطالعات مورفولوژیک و چندین روش ارزیابی آپوپتوز بود.مواد و روش ها: قطعات قشر بافت تخمدان انسان از 30 نفر تحت عمل سزارین گرفته شد و در محیط Leibovitz L-15 طی 2 ساعت به آزمایشگاه منتقل شدند. سپس قشر تخمدان به قطعات کوچکی بریده و به صورت تصادفی در دو گروه انجماد شیشه ای و کنترل غیر انجمادی تقسیم بندی شد. ارزیابی میزان وقوع آپوپتوز به وسیله مطالعات ریخت شناسی و روش هایی چون تانل، طرح نردبانی DNA و بررسی سطح بیان پروتئین های کاسپاز 3.7 به روش لومینوسنت، در بافت تخمدان صورت گرفت.نتایج: نشانه ای از تغییرات ریخت شناسی مرتبط با مرگ سلولی آپوپتوز در بافت تخمدان انسان پس از انجماد شیشه ای و ذوب دیده نشد. نشانه های آپوپتوزی و طرح نردبانی DNA در گروه انجمادی مشاهده نشد. سطح کاسپاز 3.7 در دو گروه غیر انجمادی و انجمادی به ترتیب 2231±89.271، RLU2294±169.19 بر میلی گرم پروتئین بود و بین دو گروه تفاوت معنی داری وجود نداشت.نتیجه گیری: ریخت شناسی بافت تخمدان انسان پس از انجماد شیشه ای به خوبی حفظ شد به طوری که روش انجمادی ارایه شده در مطالعه حاضر باعث افزایش آپوپتوز و نیز فعالیت کاسپاز 3.7 در بافت تخمدان نشد.

هدف: انگل تریکوموناس معمولا در دهان و گاهی اوقات در مجاری تنفسی و حتی ریه انسان یافت می شود. گرچه بیماری زا بودن این انگل در سیستم تنفسی تا به حال به اثبات نرسیده است ولی در افرادی که توجهی به بهداشت دهان و دندان ندارند یا از بیماری های مزمن تنفسی رنج می برند حضور این انگل در مجاری تنفسی شایع تر است. از این رو در این مطالعه توصیفی وجود انگل تریکوموناس با استفاده از PCR لانه گزین در نمونه خلط بیماران ریوی مزمن شامل افراد مبتلا به سرطان ریه یا بدخیمی در ریه، بیماری مزمن انسداد ریه، برونشکتازی و آسمی بستری شده در بیمارستان مسیح دانشوری در سال 1391 بررسی شد.مواد و روش ها: بدین منظور تعداد 133 نمونه خلط صبحگاهی از بیماران برای انجام آزمایش مشاهده مستقیم میکروسکوپی اخذ شد. به علاوه DNA از 60 نمونه با استفاده از کیت سیناژن استخراج شد. سپس از روش Nested-PCR برای تکثیر ژن ITS1 انگل استفاده شد. در نهایت توالی بازی نمونه های مثبت تعیین شد.نتایج: طبق نتایج به دست آمده از مشاهده میکروسکوپی اسمیر های رنگ آمیزی شده تنها 4 نمونه آلودگی به تریکوموناس مثبت تشخیص داده شد. در آزمایش Nested-PCR از 60 نمونه، تعداد 22 نمونه (36.66 درصد) به انگل تریکوموناس آلوده بودند که 33.33 درصد از زنان و 38.46 درصد از مردان را شامل می شد.نتیجه گیری: با توجه به میزان آلودگی این انگل در گروه تحت مطالعه، احتمالا ابتلا به بیماری تنفسی مزمن و آسم، زمینه را برای ابتلا بیشتر به این انگل فراهم می سازد.

هدف: این پژوهش به بررسی آسیب های بافتی ناشی از تجویز زیرجلدی مزمن میکرو و نانو ذره اکسید منگنز بر بافت های کبد، کلیه و بیضه موش های بزرگ پرداخته است.مواد و روش ها: موش ها (210 سر) به سه گروه کنترل، دریافت کننده نانو و میکرو ذره اکسید منگنز تقسیم شدند. موش ها در گروه های تجربی، هر دو هفته یک بار به مدت 14 هفته به صورت زیرجلدی محلول حاوی نانو یا میکروذرات دی اکسید منگنز (100 میکروگرم/کیلوگرم) را دریافت کردند. تعداد 5 سر موش از هر گروه به طور تصادفی هر دو هفته انتخاب و بافت های کبد، کلیه و بیضه آن ها برای بررسی بافت شناسی جمع آوری شد. ابتدا آسیب های بافتی توسط رنگ آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین ارزیابی شد، سپس برش های بافت کلیه و کبد به ترتیب توسط رنگ آمیزی جونز و تری کروم ماسون رنگ آمیزی شدند. تغییر در ضحامت غشای پایه و تعداد سلول های بخش های مختلف نفرون های کلیه در گروه های مختلف توسط نرم افزار Image Tools 2 اندازه گیری شد.نتایج: بافت کبدی در گروه های نانو و میکرو ذره از نظر بافت شناسی آسیب های شدیدی را نشان داد. توده های ابری شکلی در درون سیتوپلاسم سلول های کبدی مشاهده شدند. ساختار بافتی و مجاری صفراوی کبد دچار به هم ریختگی شدید شدند و علایم التهاب و واکنش مجاری در بافت کبدی مشاهده شد. رسوب ذرات در غشای پایه نفرون ها و کاهش معنی دار در سلول های گلومرول ها و لوله خمیده نزدیک نفرون ها در گروه نانو ذرات در مقایسه با کنترل و میکرو ذرات مشاهده شد. برخی معیارهای ساختاری و عملکردی بافت بیضه در گروه دریافت کننده نانو ذرات تغییرات پاتوبیولوژیکی معنی داری را نشان دادند.نتیجه گیری: تجویز نانو ذرات دی اکسید منگنز در مقایسه با میکرو ذرات با یک دوز ثابت سبب بروز آسیب های بافتی شدیدتری در بافت های مورد بررسی شدند. کاهش اندازه ذرات اکسید منگنز از حد میکرومتر به نانومتر به نظر می رسد که سبب تشدید مکانیسم های آسیب رسان این ذرات بر بافت های مورد بررسی شده است.

هدف: با توجه به اهمیت نقش التهاب و سایتوکین های پیش التهابی محل ضایعه بافت عصبی در ایجاد و تداوم درد ناشی از آسیب عصبی و وجود گزارش های اندک در خصوص تغییرات غلظتی این عوامل در مناطق دورتر از محل آسیب، در این تحقیق تغییرات رها شدن سایتوکین های فاکتور نکروز تومور آلفا و اینترلوکین 6 در هسته شکمی پشتی- جانبی تالاموس به دنبال درد ناشی از آسیب عصبی حاصل از ضایعه نخاعی در موش صحرایی بررسی شد.مواد و روش ها: موش های صحرایی نر از نژاد Sprague-Dawley و با محدوده وزنی 230-200 گرم انتخاب و پس از بیهوشی و لامینکتومی در قطعه نخاعی t9-t10، تحت ضایعه مسیر نخاعی- تالاموسی قرار گرفتند. آلودینیای مکانیکی و حرکت حیوان 3، 7، 14، 21 و 28 روز پس از ضایعه به ترتیب با استفاده از تارهای وون فری و آزمون میدان باز در هر دو گروه ضایعه دیده و کنترل شم ارزیابی شد. غلظت اینترلوکین 6 و فاکتور نکروز تومور آلفا نمونه های دیالیزی هسته شکمی پشتی- جانبی تالاموس طی چهار هفته بعد از آسیب نخاعی با روش الایزا تعیین مقدار شد.نتایج: آسیب مسیر جانبی نخاعی- تالاموسی موجب کاهش آستانه درد مکانیکی در هر دو پای خلفی حیوان شد به نحوی که دو هفته بعداز آسیب، آستانه عقب کشیدن پا در گروه دارای ضایعه تفاوت معنی داری نسبت به گروه شم نشان داد (P<0.05). آسیب مسیر نخاعی- تالاموسی جانبی تاثیری بر عملکرد حرکتی حیوانات نداشت. در بررسی میکرودیالیز، میزان فاکتور نکروز تومور آلفا هسته شکمی پشتی- جانبی در روزهای 3 و 7 بعد از آسیب کاهش معنی داری نسبت به گروه شم نشان داد (P<0.05) ولی با افزایش تدریجی به میزان پایه قبل از آسیب نزدیک شد. غلظت اینترلوکین 6 در نمونه های دیالیزی روز 21 بعد از آسیب افزایش یافت و اختلاف معنی داری با گروه شم داشت (P<0.05).نتیجه گیری: به نظر می رسد تخریب مسیر آوران های درد در نخاع موش صحرایی، موجب تغیییر در تولید عوامل التهابی در مناطق فوق نخاعی دورتر از ضایعه می شود. این تغییرات احتمالا موجب افزایش تحریک پذیری نورون های پس سیناپسی در مسیر تالاموسی- قشری و در نهایت به کاهش آستانه درد و بروز درد ناشی از آسیب عصبی مداوم منتهی می شود.