پژوهش های سلولی و مولکولی
سال:1395 | دوره:29 | شماره:1 |تعداد مقالات:10

کاربرد میکروارگانیسم ها بعنوان کاتالیست های طبیعی ارزان قیمت جهت کاهش و حذف پساب های حاوی سلنیت از محیط زیست بطور چشمگیری در حال افزایش است. در این مطالعه، توانمندی مخمرهای بومی دریازی مقاوم به سلنیت در بهسازی زیستی آلودگی های محیطی به سلنیت مورد بررسی قرار گرفت. نمونه گیری از دریای خزر و خلیج انجام گرفت. جداسازی از طریق غنی سازی در محیط های حاوی سلنیت صورت گرفت. از آزمون میکروپلیت الیزا برای تعیین مقاومت سویه های مخمری استفاده شد. سنجش میزان حذف سلنیت از طریق روش رنگ سنجی انجام شد. شناسایی ملکولی با تکثیر توالی نوکلئوتیدی ITS1-5.8S-ITS2 rDNA انجام شد. تاثیر پارامترهای مختلف از جمله غلظت های اولیه سلنیت، بیومس سلول، کلرید سدیم و اثرات دما، pH، دور شیکر و مدت زمان واکنش بر کارآیی فرآیند حذف بررسی شد. بر اساس نتایج بدست آمده در این مطالعه، سویه مخمری Cas se5 (جدا شده از دریای خزر) با بالاترین مقاومت (22g/L) بعنوان سویه برتر تحت نام Trichosporon شناسایی شد. نتایج به دست آمده از آزمایشات حذف سلنیت نشان داد که مخمر مذکور بیش از 93 درصد از سلنیت موجود در محیط واکنش را تحت شرایط بهینه شده غلظت سلنیت 10 گرم در لیتر، غلظت توده سلولی 35 گرم در لیتر، غلظت کلرید سدیم 2.5 2 درصد وزنی / حجمی، pH برابر 7.4، دمای 30 درجه سانتی گراد و دور همزن rpm100 حذف نموده و غلظت سلنیت اولیه از 10g/L به حدود 0.7g/L با نرخ حذف 0.26 g/L/h پس از 72 ساعت گرماگذاری کاهش یافته است. این اولین گزارش از جداسازی جنس Trichosporon با قابلیت حذف سلنیت از دریای خزر است. انتظار می رود مخمر مذکور بتواند بعنوان کاتالیست نقش مهمی در بهسازی آلودگی آبها و فاضلاب کارخانه های آلوده به سلنیت ایفا نماید.

در این تحقیق، خصوصیات زیستی و مولکولی سویه Pseudomonas fluorescens UTPF5 به عنوان یک باکتری مهم بیوکنترل در ایران، مورد ارزیابی قرار گرفته است. تاثیر نانوذرات نقره، تاثیر باکتری در لاکاز قارچی و همچنین جنبه های مولکولی باکتری از جمله ردیابی ژن های phlA و phlD و hcnAB بررسی شد. مقدار بازدارندگی این سویه از بیماریزایی نماتد Meloidogyne javanica، تعیین شد. عصاره، سوسپانسیون و ترکیبات فرار باکتری به ترتیب باعث کاهش 35، 25 و 85 درصدی در تفریخ تخم شده و افزایش مرگ و میر لارو در اثر عصاره و ترکیبات فرار باکتری به ترتیب به میزان 53-34 و 85 درصد تعیین شد درحالی که سوسپانسیون باکتری در مرگ و میر لارو تاثیری ندارد. افزایش غلظت نانوذرات نقره از 0.25 تا 2 میکرولیتر بر لیتر سبب افزایش تشکیل بیوفیلم و از این غلظت به بعد روند کاهش در تشکیل بیوفیلم می شود. سویه UTPF5 واجد ژن های phlD، phlA و hcnAB است. افزودن عصاره باکتری به محیط کشت جدایه قارچی، بر تولید آنزیم لاکاز توسط آنها تاثیر داشت و میزان تولید آنزیم در سه غلظت منتخب عصاره باکتری تفاوت معنی داری در سطح احتمال 0.01 درصد نشان داد. در بررسی های گلخانه توانایی بیوکنترل بیمارگرهای هدف و افزایش رشد گیاهان به اثبات رسید. بطور کلی این سویه P. fluorescens UTPF5 اثرات بیوکنترلی بسیار خوبی نشان داد و ویژگی های مولکولی آن نیز از طریق ردیابی ژن های مهم مورد بررسی قرار گرفت.

پروتئازها از جمله مهم ترین آنزیم های صنعتی هستند که حدود 65 درصد از بازار جهانی آنزیم های صنعتی و حدود 25 درصد از تولید کل آنزیم ها را به خود اختصاص داده اند. پروتئازها در صنایع مختلف از جمله افزودنی های شوینده ها، تیمار فاضلاب، بازیافت نقره و در صنایع غذایی، چرم سازی، بازیافت نقره از فیلم های عکس برداری با اشعه ایکس و داروسازی کاربرد دارند. در این تحقیق باکتری مولد آنزیم پروتئاز از پساب کارخانه شیر پگاه کرمان جداسازی شد. ایجاد هاله در اطراف کلنی های رشد کرده در محیط حاوی اسکیم میلک آگار (5 درصد) نشانگر فعالیت پروتئولیتیک می باشد. سویه دارای بالاترین فعالیت پروتئازی از لحاظ بیوشیمیایی و مولکولی (توالی یابی ژن 16S rRNA) شناسایی شد که Chryseobacterium indologenes می باشد. پروتئاز تولیدی توسط این سویه در سه مرحله رسوب گذاری با آمونیوم سولفات، دیالیز در بافر تریس 35 میلی مولار و کروماتوگرافی تعویض یونی Q -سفاروز به طور نسبی خالص شد. میزان فعالیت پروتئازی با استفاده از روش زایموگرافی مورد تایید قرار گرفت. این آنزیم دارای بیشترین فعالیت در دمای 40 درجه سانتی گراد، pH8 و بیشترین پایداری در دمای 40 درجه سانتی گراد، pH8-9 می باشد. تریتون X-100 و شوینده تجاری تاژ باعث افزایش فعالیت و پایداری فعالیت پروتئازی شدند. آنزیم پروتئاز تولید شده در غلظت شوری 1 درصد بیشترین فعالیت پروتئازی را نشان می دهد. این نتایج خاطرنشان می سازد که این آنزیم قابلیت استفاده در بیوتکنولوژی از جمله در صنایع شوینده، فرآوری گوشت و سنتز ترکیبات با ارزش را دارا می باشد.

پروتئین E-cadherin یکی از اعضاء فوق خانواده پروتئین های E-cadherin است که بطور عمده در سطح سلول های بافت های اپیتلیال بیان می شود. کاهش بیان این پروتئین علاوه بر تضعیف اتصالات بین سلولی، موجب بروز پدیده Epithelial-mesenchymal transition (EMT) و مهاجرت و متاستاز سلول های سرطانی بافت های اپیتلیال می شود. در طب سنتی، از انار (Punica granatum) برای درمان بسیاری از بیماری ها از جمله اسهال، بیماریهای قلبی و فشار خون استفاده می شود. در این تحقیق اثر عصاره استونی میوه انار بر میزان بیان پروتئین های b-catenin و E-cadherin در سلول های PC-3 بررسی شد. برای این منظور پس از بررسی اثر سمیت غلظت های مختلف عصاره، استخراج RNA و پروتئین کل از سلول های تیمار شده صورت گرفت. نتایج آزمایشات MTT نشان داد که عصاره استونی دانه انار قادر است حیات سلولهای PC-3 را به خصوص در غلظتهای بالاتر از 100 میکروگرم در میلی لیتر مهار کند. همچنین IC50 عصاره استونی دانه انار در حدود 86 میکروگرم در میلی لیتر تخمین زده شد. نتایج آزمایشات وسترن بلاتینگ نیز نشان داد که تیمار سلول های PC-3 با غلظت های 20 و 50 میکروگرم در میلی لیتر عصاره دانه انار موجب افزایش مقدار پروتئین b -catenin و E-cadherin به میزان تقریبی 1.5 و 2.2 برابر می شود. نتایج این پژوهش پیشنهاد می کند احتمالا دانه انار پتانسیل بالایی در مهار متاستاز سلول های سرطانی با افزایش بیان پروتئین های دخیل در اتصالات سلولی از جمله b –catenin و E-cadherin دارد.

گذر از مرحله رویشی به زایشی یکی از مهم ترین فرآیندهای تکاملی گیاهان است که سازوکار مولکولی آن هنوز به طور کامل شناخته نشده است. آغاز گلدهی در گیاهان توسط عوامل مختلفی از قبیل طول دوره نوری، دوره سرما، هورمونها و عوامل اپی ژنتیک کنترل می شود. یک مسیر مهم در این فرآیند، کنترل اپیژنتیکی ژن FLC است که بیان آن موجب مهار گلدهی می گردد. حذف گروههای استیل از روی هیستون های ژن FLC توسط پروتئین MSI4 باعث توقف بیان FLC شده و بنابراین، گلدهی آغاز میشود. با این حال، مکانیسم عمل این پروتئین هنوز تا حدود زیادی ناشناخته است. بنابراین، بررسی هر گونه میانکنش مولکولی با این پروتئین در شناخت مکانیسم عمل آن اهمیت دارد. در این تحقیق، برای یافتن شریک مولکولی پروتئین MSI4 در انجام فرآیند داستیلاسیون، از سیستم دوبل هیبرید مخمر که یکی از مهم ترین روشهای ردیابی میانکنشهای مولکولی میباشد، استفاده شد. برای این کار، ابتدا ژن MSI4 در ناقل دوبل هیبرید مخمر همسانهسازی شد. سپس، MSI4 به عنوان طعمه برای غربال در کتابخانه cDNA گیاه آرابیدوپسیس به روش دوبل هیبرید مخمر استفاده شد. پروتئینی که با این روش به دام افتاد، PKT3 ( Peroxisomal 3-Ketoacyl-CoA Thiolase 3) بود که یک استیل کوآسیل ترانسفراز است. وظیفه این پروتئین آزاد کردن و انتقال بنیان های استیل به مولکول ها است و از این رو در بسیاری از فرآیندهای حیاتی سلول نقش دارد. این میانکنش به وسیله همسانه سازی cDNA کامل پروتئین PKT3 و همچنین هومولوگ آن PKT4 به طور مستقل تایید شد. گزارش میانکنش MSI4-PKT3 میتواند افقهای روشنی را برای مطالعات بیشتر در مورد مکانیسم عمل MSI4 پیش روی پژوهشگران قرار دهد. از این دستاورد مثلا با تغییر بیان ژن PKT4 می توان برای تنظیم زمان گلدهی در تولید محصولات زراعی و باغی استفاده کاربردی کرد.

توانایی و امکان تعیین جنسیت گوساله در صنعت دامپروری بسیار حائز اهمیت است و یکی از اهداف دیرینه در صنعت گاو شیری و گوشتی به شمار می رود. گاو نر در مقایسه با گاو ماده به علت هتروگامتیک بودن سهم بیشتری در نسبت جنسی ایفا می کند. تشخیص نسبت جنسی اسپرماتوزوئیدها از طریق نسبت کروموزوم های X و Y قابل انجام است. این پژوهش با هدف تاثیر غلظت تستوسترون خون بر تغییر نسبت جنسی کروموزوم هایX و Yاسپرماتوزوئیدها در گاوهای هلشتاین از طریق تکنیک Real-Time PCR انجام گرفت. در این تحقیق از 26 راس گاو نر هلشتاین موجود در مرکز اصلاح نژاد ایستگاه عباس آباد مشهد، خون گیری و اسپرم گیری انجام شد. پس از استخراج DNA از اسپرم به روش بهینه یافته استخراج نمکی، Real-Time PCR برای تکثیر قطعات 90، 89 و 79 جفت بازی به ترتیب برای ژن هایPLP ،SRY و  PARبا استفاده از جفت آغازگرهای اختصاصی انجام گرفت و نسبت جنسیت محاسبه شد. نتایج آنالیز آماری نشان داد که میانگین حداقل مربعات کروموزوم Y و X به ترتیب 0.15±1.23 و 0.02±0.71 بود و از نظر آماری داری تفاوت معنی داری بودند (P<0.05). همچنین همبستگی نسبی ژن SRY با غلظت تستوسترون خون برابر با 0.38 برآورد شد که این نتایج نشان می دهد با افزایش سطح تستوسترون میزان نسبی اسپرماتوزوئیدهای حامل ژن SRY به طور معنی داری (P<0.05) افزایش یافت. همچنین همبستگی بین ژن PLP و تستوسترون خون برابر با 67/.- برآورد شد. لذا با افزایش غلظت تستوسترون میزان نسبی اسپرماتوزوئیدهای حامل ژن PLP به طور معنی داری (P<0.01) کاهش یافت.

ساخت نانوسامانه های هدفمند انتقال دارو از یک طرف امکان دسترسی زیستی به دارو را بهبود بخشیده و از طرف دیگر اثرات جانبی زیان بار آن را بر سایر نقاط بدن به حداقل ممکن رسانده است. از جمله این نانوسامانه ها می توان به نانوذرات اکسید آهن اشاره کرد که امروزه به صورت گسترده در تصویربرداری تشدید مغناطیسی به عنوان عامل بهبود کیفیت تصویر استفاده می شود. این خاصیت ممتاز این نانوذرات همراه با قابلیت هدفمند کردن آن ها از طریق میدان مغناطیسی خارجی سبب جلب توجه بسیاری از محققین به آن ها شده است. پوشش دهی سطح نانوذرات توسط پلیمرهای زیست سازگار سبب بهبود خواص زیستی آن ها می شود. در این زمینه می توان به پلیمرهای پرشاخه اشاره کرد که با دارا بودن تعداد زیادی گروه عاملی سطحی می توانند به صورت هدفمند داروها را منتقل کنند. هدف از این پژوهش ساخت نانوذرات اکسید آهن، پوشش دهی آن توسط پلیمر پرشاخه پلی گلیسرول و مقایسه زیست سازگاری نانوذرات پوشش دار و بدون پوشش است. در ابتدا نانوذرات با استفاده از روش تجزیه حرارتی ساخته شده و سپس توسط روش حلقه گشا پوشش دهی شد. در انتها به منظور ارزیابی زیست سازگاری از آزمون سمیت سلولی (MTT assay) استفاده شد. نتایج مربوط به بررسی و مشخصه یابی نانوذرات به خوبی نشان دهنده ساخت نانوذرات با قطر متوسط 11 نانومتر و پوشش دهی موفق آن ها توسط پلیمر پرشاخه بود. به علاوه بررسی های مربوط به زیست سازگاری سلولی نشان داد که نمونه های بدون پوشش از غلظت 200mg/ml به بالا دارای سمیت سلولی بودند در حالی که نمونه های پوشش دار فاقد این اثر سمیت بود.

گیاه شقایق (Papaver somniferum L.) به عنوان مهمترین منبع اقتصادی تولید ترکیبات آلکالوئیدی نارکوتیک مانند کدئین، تبائین، نارکوتین و پاپاورین شناخته شده است و از ترکیبات آن در صنعت داروسازی به عنوان بی حس کننده، ضد سرفه و ضد اسپاسم استفاده می شود. امروزه از فن مهندسی متابولیک، برای دستورزی ژن های بیوسنتز آلکالوئیدها و فرآورده های متابولیکی این گیاه از طریق مهندسی ژنتیک استفاده می شود. کدئین ا- دمتیلاز (CODM)، آنزیم انتهایی در مسیر بیوسنتزی مورفینان در گیاه شقایق می باشد که باعث دمتیلاسیون تبائین در موقعیت 3 و تبدیل آن به اوریپاوین و همچنین دمتیلاسیون کدئین می شود. این پژوهش با هدف خاموشی احتمالی ژن CODM از طریق مکانیسم خاموشی ژن به واسطه ویروس (VIGS) به اجرا در آمد. ابتدا ژن CODM با استفاده از آغازگرهای اختصاصی از روی cDNA تکثیر شد. بخشی از انتهای cDNA سنتز شده در ناحیه 3’UTR، به عنوان قطعه هدف خاموشی در ناقل ویروسی TRV2 همسانه سازی شد و سازه ژنی با استفاده از اگروباکتریوم به نمونه های برگی گیاه شقایق انتقال داده شد. بوسیله PCR ژن پروتئین پوششی ویروس TRV، گیاهان تراریخت غربال اولیه شدند و سپس آنالیز نیمه کمی بیان ژن CODM روی تعدادی از آنها انجام شد. آنالیز نهایی خاموشی ژن ناشی از مکانیسم VIGS با استفاده از PCR زمان واقعی در بهترین گیاهان تراریخت انتخاب شده، کاهش 95 درصدی بیان ژن CODM در مقایسه با نمونه های شاهد را نشان داد.

امروزه جهت افزایش میزان لانه گزینی و حاملگی پس از انتقال رویان های حاصل از لقاح آزمایشگاهی، از تکنیک های مختلف هچینگ کمکی از جمله سوراخ کردن مصنوعی بلاستوسیست استفاده می شود. در این مطالعه با سوراخ کردن مصنوعی بلاستوسیست با استفاده از ریز سوزن های تزریق کننده، کیفیت بلاستوسیست های موش با بررسی نرخ زنده مانی، خروج بلاستوسیست از زونا و میزان بیان ژن Wnt3a مورد ارزیابی قرار گرفت. بلاستوسیست ها در دو گروه درون تنی و برون تنی مورد مطالعه قرار گرفتند. در هر گروه تعدادی از بلاستوسیست ها با استفاده از ریز سوزن های تزریق کننده به روش مکانیکی سوراخ شدند و تعدادی دیگر بدون هیچ تیماری به عنوان گروه کنترل در نظر گرفته شدند. نرخ زنده مانی و قابلیت خروج بلاستوسیست ها از زونا و همچنین میزان بیان ژن Wnt3a توسط تکنیک واکنش زنجیره ای پلیمراز در زمان واقعی در هر گروه ارزیابی گردید. بر اساس نتایج بدست آمده در بلاستوسیست های درون تنی و برون تنی گروه تیمار در مقایسه با کنترل میزان زنده مانی کاهش نیافت در مقابل میزان خروج بلاستوسیست از زونا افزایش معنی داری نشان داد. در گروه بلاستوسیست های درون تنی میزان بیان ژن Wnt3a افزایش معنی دار و در گروه بلاستوسیست های برون تنی کاهش معنی دار یافت. سوراخ کردن مصنوعی بلاستوسیست می تواند یک روش مطمئن در هچینگ کمکی بکار رود.

دفنزین های گیاهی، خانواده ای از پپتیدهای ضد میکروبی کاتیونی کوچک و غنی از سیستئین هستند که فعالیت های ضد میکروبی وسیعی دارند. هدف این مطالعه طراحی، سنتز، همسانه سازی، بیان ژن دفنزین گندم (Triticum aestivum) و بررسی خاصیت ضد باکتری پروتئین نوترکیب حاصل بود. توالی ژن دفنزین به همراه ژن سومو (sumo) جهت افزایش حلالییت پروتئین و بیان بیشتر، توسط نرم افزارهای مختلف بهینه سازی شده، سنتز و در وکتور pGH همسانه سازی شد. سپس توالی ترکیبی سومو- دفنزین در ناقل بیانی (+) pET-32a زیر همسانه سازی و به سلول های باکتریایی (E.coli origami) منتقل گردید. بیان ژن تحت القای IPTG یک میلی مولار در دمای 30 درجه سانتی گراد صورت گرفت و پروتئین نوترکیب توسط SDS-PAGE و وسترن بلات بررسی شد. پروتئین نوترکیب، با وزن مولکولی حدود 38 کیلودالتون روی ژل SDS-PAGE آنالیز شد و توسط وسترن بلات تائید گردید. پس از برش پروتئین با آنزیم سومو پروتئاز، محصول به دست آمده برای بررسی اثر ضد باکتریایی مورد استفاده قرار گرفت. اثر پروتئین دفنزین گندم نوترکیب بر باکتریهای بیماریزای گیاهی گرم منفی زانتوموناس آگزونوپودیس و سودوموناس سیرینگهو بر باکتریهای گرم منفی و گرم مثبت بیماریزای انسانی مانند اشریشیا کولای، کلبسیلا پنومونیه، استافیلوکوکوس اورئوس و باسیلوس سرئوس مورد ارزیابی قرار گرفت که در برابر باکتریهای زانتوموناس آگزونوپودیس، استافیلوکوکوس اورئوس و باسیلوس سرئوس اثر ضد باکتریایی از خود نشان داد. بر اساس ویژگی ضد میکروبی دفنزین گندم، این مطالعه می تواند در معرفی این پپتید، به عنوان یک عامل ضد میکروبی جدید، موثر باشد.