پژوهش های آسیب شناسی زیستی
سال:1386 | دوره:10 | شماره:4-3 |تعداد مقالات:13

هدف: بیماری بتا - تالاسمی در اثر غیاب یا کاهش سنتز زنجیره بتاگلوبین به وجود می آید. یکی از روش های درمانی موثر برای این بیماری ژن درمانی توسط ناقل های ویروسی است. ظرفیت ناقل های لنتی ویروسی حدود 8 کیلو باز است. با توجه به ظرفیت محدود ناقل های لنتی  ویروسی از miniLCR طراحی شده به طول 6 کیلو باز به جای ناحیه تنظیمی LCR در کنار ژن بتاگلوبین استفاده شد. هدف از این مطالعه ساخت لنتی  ویروس های نوترکیب حاوی ژن بتاگلوبین و miniLCR برای انتقال سازه ژنی مورد نظر به سلول های هدف به منظور ژن درمانی بتا - تالاسمی ماژور است. مواد و روش ها: هر یک از قطعات HS2، HS3، (miniLCR) HS4 و ژن بتاگلوبین به همراه نواحی 5' UTR و '3 از DNA  ژنومی افراد سالم با روش PCR تکثیر شد. هر یک از آن ها پس از کلونینگ در ناقل pTZ57R/T و ساب کلونینگ در ناقل pBGGT در نهایت در یک ناقل لنتی ویروسی به نام pLenti-Dest ساب کلون شد. طی ترانسفکشن همزمان ناقل نهایی به همراه سه ناقل کمکی (Plp/VSVG، Plp2، Plp1) با لیپوفکتامین 2000 به درون رده سلولی 293T، لنتی ویروس های نوترکیب حاوی سازه ژنی مورد نظر تولید و با RT-PCR تایید شدند.نتایج: تیتر این لنتی ویروس های نوترکیب در رده های سلولی  COS-7و K562 یکسان بود. MOI بهینه این ویروس ها برای سلولCOS-7 ، 5 به دست آمد. ترانسداکشن سلول های هدف در حضور پلی برن 2 برابر شد. سلول های COS-7 ترانسدیوس شده پس از دو هفته انتخاب آنتی بیوتیکی باقی ماندند. DNA این کلونی های باقی مانده استخراج و با روش PCR وارد شدن سازه ژنی ساخته شده تایید شد.نتیجه گیری: لنتی ویروس ها می توانند وسیله ای مناسب برای انتقال سازه ژنی فوق به سلول های هدف در حال تقسیم و آن هایی که تقسیم نمی شود مانند سلول های بنیادی با هدف ژن درمانی بیماری های خونی مانند بتا - تالاسمی باشند. کارایی استفاده از لنتی ویروس ها بیشتر از روش هدف گیری ژنی در ژن درمانی بتا - تالاسمی است. انتظار می رود با استفاده از واحدهای  HS2و HS3 و HS4 در mini LCR به جای LCR در کنار ژن بتاگلوبین و نیز انتخاب قطعه HS3 با طول بزرگتر میزان بیان بتاگلوبین را افزایش دهد.

هدف: هدف از این مطالعه بررسی سرواپیدمیولوژیک کیست هیداتید انسانی، با روش الایزا در استان کردستان است. مواد و روش ها: با توجه به نتایج به دست آمده از مطالعات قبلی حجم نمونه 1979 نفر به دست آمد. روش کار بدین ترتیب بود که ابتدا از تمام افراد مورد مطالعه پس از تکمیل پرسشنامه، نمونه خون گرفته شد و سرم تمام افراد در رقت 1:400 با آزمون الایزا آزمایش شد.نتایج: نتایج به دست آمده نشان داد که از مجموع افراد مورد مطالعه، 22 نفر (1.12 درصد) با آزمون الایزا واکنش مثبت نشان دادند؛ از این افراد، 10 نفر (0.9 درصد) از جمعیت شهری، 12 نفر (1.42 درصد) از جمعیت روستایی بودند. همچنین 1.65 درصد زنان و 0.45 درصد مردان جمعیت تحت مطالعه با این روش مثبت بودند و بیشترین درصد آلودگی در گروه سنی 40-30 (1.59 درصد) مشاهده شد. بر اساس این مطالعه میان درصد آلودگی به کیست هیداتید در میان زنان و مردان اختلاف معنی داری وجود داشت. همچنین اختلاف درصد آلودگی گروه سنی سی تا چهل سال با گروه های سنی دیگر معنی دار بود. اما بین درصد آلودگی به کیست هیداتید و جمعیت شهری و روستایی اختلاف معنی داری مشاهده نشد.نتیجه گیری: بر اساس نتایج به دست آمده از این تحقیق بیشترین درصد آلودگی در شهرستان دیواندره (1.69 درصد) به دست آمد. علت این اختلاف این است که بیشترین جمعیت روستایی استان که به امر کشاورزی و دامداری مشغول هستند در این شهرستان متمرکزند.

کاربردهای بالینی سلول های بنیادی جنینی از یک سو با مشکل پس زدن بافت و از سوی دیگر با محدودیت های اخلاقی روبروست. یک راه حل برای این موضوع باز برنامه ریزی سلول های سوماتیک به کمک انتقال هسته آنها به اووسیت یا زیگوت است. اما پیچیدگی های فنی و ملاحظات اخلاقی موجود، کاربرد بالینی این فن آوری را نیز با مشکل مواجه کرده است. راهکاری که به تازگی ابداع شده القای باز برنامه ریزی در سلول های بالغ در شرایط محیط آزمایشگاه است. این کار اولین بار به واسطه بیان چهار فاکتور رونویسی به نام های Oct4، Sox2،c-Myc  و Klf4  انجام شده است. پس از آن به منظور بهینه سازی و نزدیک کردن این فن آوری به کاربردهای بالینی تلاش های بسیاری صورت گرفته است، اما به نظر می رسد هنوز راه درازی در پیش است. در این مقاله راهکارهای موجود برای باز برنامه ریزی سلول های سوماتیک به دوران جنینی بررسی و سپس در مورد استراتژی اخیر و پیشرفت های صورت گرفته در آن بحث می شود.

هدف: اپیدمی جهانی ویروس نقص سیستم ایمنی انسان به حدی ادامه یافت که از پیش بینی های قبلی نیز فراتر رفت. امیدوار کننده ترین وسیله برای کاهش این اپیدمی، یک واکسن موثر است. واکسن های DNA پاسخ ایمنی همورال و سلولی را القا می نمایند و مشابه واکسن های زنده عمل می کنند بدون آن که پتانسل بیماریزایی آن را داشته باشند.اهمیت ایمنی سلولی در کنترل ویرمی ویروس نقص سیستم ایمنی انسان و ویروس نقص سیستم ایمنی میمون منجر به هدایت تولید یک سری از کاندیدهای واکسن شده است که به طور موثری این پاسخ ها را القا می نمایند. در حال حاضر اعتقاد بر این است که یک استراتژی واکسن ویروس نقص سیستم ایمنی می بایست هر دو پاسخ ایمنی همورال و همین طور سلولی را تحریک نماید. p24 و gp41 نقش های بسیار مهمی را در واکنش متقابل ویروس - میزبان و بیماری زایی بازی می کنند. این پروتئین ها به عنوان کاندید قابل توجه واکسن، در نظر گرفته می شوند چرا که آثار ایمنی زایی و تعدیل ایمنی آن ها ثابت شده است. مواد و روش ها: در این مطالعه، پاسخ ایمنی سلولی موثر علیه یک ناقل بیانی (pcDNA 3.1 Hygro) حاوی توالی های ایمونوژنیک p24-gp41، به عنوان کاندید واکسن DNA در موش های Balb/C، ارزیابی شد. برای ایمن سازی از دندروزوم استفاده شد که یک خانواده جدید از وسایل انتقال برای ترانسفکشن و درمان است. میزان اینترفرون گاما و آنتی بادی کل، با الایزا و تقسیم سلولی لنفوسیتی نیز با MTT سنجش شد. نتایج: آزمایش الایزا و MTT تایید نمودند که ژن الحاقی p24-gp41 قادر به افزایش پاسخ ایمنی در موش ها است. نتیجه گیری: ساختاری که در این تحقیق استفاده شده می تواند کاندید خوبی برای واکسن DNA علیه ویروس نقص سیستم ایمنی انسان نوع یک باشد اگر آزمایش های تکمیلی بعدی نیز همانند آزمایش های انجام شده در این تحقیق، ایمن زایی این قطعات ملحق شده را تایید نماید.

هدف: در سلول های تک ‏هسته ای و چند هسته ای خون محیطی نیتریک اکساید توسط آنزیمی به نام نیتریک اکساید سنتاز القایی تولید می شود. ژن کد کننده این آنزیم (NOS2A) روی کروموزوم 17q11.21 قرار دارد. نیتریک اکساید در پاسخ های التهابی آزاد می شود. در این مطالعه چندشکلی های ژن NOS2A در افراد طبیعی و تاثیر آن بر میزان تولید نیتریک اکساید در سلول های تک هسته ای و چند هسته ای خون محیطی افراد طبیعی بررسی شد. مواد و روش ها: چند شکلی های موجود در موقعیت های -1659 C/T و +150 C/T ژن NOS2A در 232 فرد طبیعی به ترتیب با روش های PCR-Allele Specific و PCR-RFLP مورد بررسی قرار گرفت. برای بررسی اثر این چند شکلی ها بر میزان تولید نیتریک اکساید، سلول های تک هسته ای و چند هسته ای خون محیطی 92 فرد طبیعی جدا شدند و با مایع رویی کشت حاصل از باکتری اشرشیاکلی (ATCC 25922) به منظور القای آنزیم نیتریک اکساید سنتاز القایی و تولید نیتریک اکساید تحریک شدند. پس از گذشت 24 ساعت میزان تولید نیتریک اکساید در مایع رویی محیط کشت سلولی با روش گریس اندازه گیری شد و تاثیر این چندشکلی ها بر میزان تولید نیتریک اکساید در این افراد مورد مطالعه قرارگرفت.نتایج: در میزان تولید نیتریک اکساید بین ژنوتیپ های مختلف حاصل از دو چندشکلی مذکور در سلول های تک هسته ای و چند هسته ای خون محیطی افراد طبیعی تفاوتی مشاهده نشد.نتیجه گیری: نتایج نشان دهنده عدم تفاوت در میزان تولید نیتریک اکساید در ژنوتیپ های مختلف NOS2A است. هیچ گونه شباهتی بین جمعیت طبیعی ایران با گامبیا و چین مشاهده نشد. این تفاوت ها ناشی از تفاوت های نژادی و ژنتیکی بین جمعیت های بررسی شده است. با توجه به اهمیت چندشکلی های NOS2A در میزان تولید نیتریک اکساید مطالعات بیشتر در سایر گروه های نژادی پیشنهاد می شود.

هدف: لوسمی (سرطان خون) میلوئیدی مزمن یک بیماری کلونال بدخیم سلول های پایه خون ساز است که نتیجه آن افزایش سلول های میلوئیدی، اریتروئیدی و پلاکت ها در خون محیطی و هیپرپلازی در مغز استخوان است. تحقیقات انجام شده واریانت های متفاوتی از BCR-ABL را در بیماران لوسمی میلوئیدی مزمن نشان داده است. تاکنون در ایران صرفا 3 واریانت در برخی از آزمایشگاه های تشخیص طبی شناسایی می شود که یکی از دلایل آن عدم طراحی و استفاده از آغازگرهایی است که به طور همزمان بتواند کلیه واریانت ها را شناسایی کند. در این مطالعه با روش RT-Multiplex PCR کلیه واریانت ها در بیماران لوسمی میلوئیدی مزمن شناسایی شد.مواد و روش ها: نمونه خون از یکصد فرد تحت درمان یا در مرحله تشخیص بیماری دریافت و سپس با استفاده از کیت تجارتی Roche از 600 میکرولیتر کلیه نمونه ها RNA استخراج شد. RNA استخراج شده توسط آنزیم نسخه برداری معکوس به cDNA تبدیل و با استفاده از 2 جفت آغازگر نمونه ها برای واریانت های BCR-ABL مورد آزمایش قرار گرفتند. به موازات کلیه نمونه ها به روش RT-Multiplex Nested PCR روی ژل آگارز بررسی شد.نتایج: RT-Multiplex PCR توانست BCR-ABL را در تمام نمـونه هایی که برای این mRNA ژن ادغامی مثبـت بوده اند نشـان دهـد. در یکـصـد نـمونـه جـمـع آوری شــده به روشRT-Multiplex PCR ، 46 درصـد مثبـت و 54 درصـد مـنفـی و به روش 44 ,RT-Multiplex Nested PCR درصد مثبت و 56 درصد منفی بوده است.نتیجه گیری: ما در این تحقیق با استفاده از یک PCR یک مرحله ای توانستیم واریانت های بیشتری از BCR- ABL را در یک لوله در زمان کوتاه تر و هزینه کمتر شناسایی کنیم، ضمن مقایسه معلوم شد این روش از اختصاصیت 100 درصد برخوردار است. این پژوهش می تواند با استفاده از تعداد نمونه های بیشتر برای تشخیص سایر واریانت ها و روش Real Time PCR برای بررسی کمی نمونه ها کامل تر شود.

هدف: در مطالعات اخیر نشان داده شده است که آنتی بادی های ضد پپتید حلقوی سیترولینه (Anti-CCP) دارای ویژگی بسیار بالا برای تشخیص آرتریت روماتویید بوده و در پیش بینی ابتلا به این بیماری و تعیین پیش آگهی آن مفید هستند. ما در این مطالعه ارزش تشخیصی آنتی بادی های ضد پپتید حلقوی سیترولینه را در گروهی از بیماران مبتلا به آرتریت روماتویید ارزیابی کردیم.مواد و روش ها: آنتی بادی ضد پپتید حلقوی سیترولینه و فاکتور روماتویید در 247 نمونه سرم مورد آزمایش قرار گرفت. نمونه ها مربوط به 128 بیمار مبتلا به آرتریت روماتویید و 119 فرد غیر مبتلا به این بیماری (شامل 48 فرد سالم و 71 بیمار مبتلا به دیگر بیماری های نسج همبند یا بدخیمی های خونی) به عنوان گروه شاهد بود.نتایج: تعداد مبتلایان به آرتریت روماتویید 128 نفر (93 زن، 35 مرد) و تعداد گروه شاهد 119 نفر (78 زن، 41 مرد) بود. حساسیت آنتی بادی ضد پپتید حلقوی سیترولینه برای تشخیص آرتریت روماتویید 66.40 درصد و ویژگی آن 94.11 درصد بود. حساسیت فاکتور روماتویید برای تشخیص آرتریت روماتویید 69.53 درصد و ویژگی آن 81.51 درصد بود.نتیجه گیری: در بیماران ما آزمون آنتی بادی ضد پپتید حلقوی سیترولینه دارای حساسیت متوسط ولی ویژگی بالایی برای تشخیص آرتریت روماتویید است.

هدف: در این مطالعه حشره شناسی برای تعیین پشه خاکی های ناقل لیشمانیا، تعداد 358 پشه خاکی متعلق به جنس سرژنتومیا در کانون بومی لیشمانیوز احشایی شمال غرب ایران بررسی شدند.مواد و روش ها: DNA سینه و شکم پشه خاکی  استخراج شد و آلودگی طبیعی آن ها به لپتوموناد به کمک روش semi-nested PCR  و تعیین توالی بخشی از ژن ITS-rDNA مورد آزمایش قرار گرفت.نتایج: نتایج نشان داد که دو نمونه پشه خاکی سرژنتومیا دنتاتا به انگل های لیشمانیای خزندگان متعلق به زیرجنس سارولیشمانیا آلوده بودند. آنالیز و مقایسه توالی DNA ژن مربوط با اطلاعات بانک جهانی ژن نشان داد که توالی آن 76 درصد با لیشمانیا (سارولیشمانیا) آدلری مشابهت دارد. با این حال برای تعیین هویت نهایی آن ها باید مطالعات بیشتری صورت پذیرد. از نکات جالب توجه این که در این مطالعه یک عدد پشه خاکی گونه سرژنتومیا سینتونی از اماکن انسانی صید شد که از خون هموگلوبین دار میزبان پستاندار تغذیه کرده بود.نتیجه گیری: زیر جنس سارولیشمانیا به علت فقدان فاکتور لیپوفسفوگلیکان توانایی ورود به سلول های فاگوسیت کننده را نداشته و برای انسان بیماری زا نیستند. گلیکواینوزیتول فسفولیپید ساختاری است که در این نوع انگل ها وجود داشته و با سرم بیماران کالاآزاری، کمپلکس آنتی ژن - آنتی بادی ایجاد می نماید. به علت شباهت آنتی ژنیکی این نوع انگل ها  و انگل های لیشمانیای آلوده کننده پستانداران، در بررسی های سرولوژیک امکان گزارش مثبت های کاذب کالاآزار وجود دارد. ناقل این نوع انگل ها جنس سرژانتومیا است که بعضی از زیر جنس های آن مانند سینتونیوس مشخصات حد واسط جنس فلبوتوموس را نشان می دهند. بعضی از گونه های این زیر جنس، قادر به گزش انسان هستند. این نخستین گزارش از خونخواری سرژنتومیاها از پستانداران و حضور انگل مشابه لیشمانیا (سارولیشمانیا) آدلری در ایران است.

هدف: لژیونلا پنوموفیلا عامل بیش از 95 درصد پنومونی شدید لژیونلایی است. جداسازی عامل ایجادکننده پنومونی از نمونه های مایع برونکوآلوئولار با کشت یک فرآیند حساس و زمانبر است. بعضی گونه های لژیونلا با وجود زنده بودن در نمونه بالینی، در محیط کشت رشد نمی کنند. هدف از این مطالعه جداسازی لژیونلا از نمونه های مایع برونکوآلوئولار با دو روش PCR و کشت است.مواد و روش ها: در این مطالعه از 70 بیمار مشکوک به پنومونی لژیونلایی، نمونه مایع برونکوآلوئولار تهیه شد. نمونه ها روی محیط اختصاصی لژیونلا (BCYE) کشت داده شدند. تمامی نمونه ها نیز با استفاده از آغازگرهای اختصاصی (ژن mip) با روش PCR ارزیابی شدند.نتایج: از 70 نمونه مایع برونکوآلوئولار مورد بررسی، (4.2 درصد) 3 نمونه با کشت و (8.4 درصد) 6 نمونه باPCR  مثبت شدند. تمامی نمونه های کشت مثبت با PCR هم مثبت بودند. از طرفی علایم بالینی بیماران نیز کاملا با نتایج به دست آمده در آزمایشگاه مطابقت داشت.نتیجه گیری: تشخیص سریع و دقیق لژیونلا پنوموفیلا برای درمان عفونت های شدید ناشی از این باکتری بسیار مهم است. آنالیز نتایج ما نشان داد که حساسیت و سرعت روش PCR خیلی بیشتر از کشت در نمونه های مایع برونکوآلوئولار برای شناسایی لژیونلا پنوموفیلا است. بنابراین روش PCR می تواند روشی مناسب برای جدا سازی و شناسایی لژیونلا پنوموفیلا از نمونه مایع برونکوآلوئولار در بیماران مبتلا به پنومونی شدید باشد.

هدف: نوکلئوستمین جزء خانواده ای از پروتئین های هستکی است که به میزان زیادی در سلول های بنیادین جنینی، عصبی و مزانشیمی بیان می شود و در تنظیم خود بازسازی این سلول ها نقش دارد. بیش بیان این ژن در رده های سلولی سرطانی متعدد و نیز بافت های توموری چون تومورهای معده، کبد و پروستات نشان داده شده است. هدف از مطالعه حاضر، بررسی آثار سرکوب بیان این ژن در رده سلولی سرطانی مثانه با روش RNAi است. مواد و روش ها: پس از تایید بیان ژن نوکلئوستمین در رده سلولی سرطانی 5637، الیگونوکلئوتیدهای 21 تایی بر علیه آن به داخل سلول ترانسفکت شده و سرکوب بیان ژن با روش RT-PCR، ایمونوسیتوشیمی و وسترن بلات تایید شد. آنالیز رشد سلولی با شمارش سلول ها انجام گرفت. تغییرات در چرخه سلولی و رخداد مرگ برنامه ریزی شده سلول به ترتیب با رنگ آمیزی سلول ها با رنگ پروپیودیم آیودید وآنکسین V-FITC مورد بررسی قرار گرفت.نتایج: ژن نوکلئوستمین به میزان بالایی در سلول های 5637 بیان می شود. بررسی بیان ژن نوکلئوستمین با روش نیمه کمی و پس از تیمار با الیگونوکلئوتیدهای اختصاصی بر علیه این ژن، کاهشی در حدود 85 درصد را در مقایسه با گروه های کنترل نشان داد. علاوه بر این، نتایج ایمونوسیتوشیمی و وسترن بلات نیز تایید کننده سرکوب بیان ژن در حد پروتئین بود. بررسی منحنی رشد سلول ها نشان داد که با گذشت 72 ساعت، کاهش قابل ملاحظه ای در تعداد سلول های گروه تیمار شده با الیگونوکلئوتیدهای نوکلئوستمین قابل مشاهده است. بررسی چرخه سلولی نیز بیانگر رخداد مرگ برنامه ریزی شده سلول پس از مهار نوکلئوستمین بود که رنگ آمیزی اختصاصی با آنکسین V-FITC نیز این یافته را تایید نمود.نتیجه گیری: بیان ژن نوکلئوستمین نقش مهمی در تکثیر سلولی و جلوگیری از مرگ برنامه ریزی شده سلول در سلول های رده سرطانی 5637 ایفا می کند. مطالعات بیشتر در زمینه سرکوب بیان این ژن در محیط بدن می تواند در آینده راهگشای یافتن هدف های درمانی بالقوه برای سرطان مثانه شود.

هدف: انکوپروتئین E1A در آدنوویروس تیپ 5 یک فاکتور تنظیمی است که موجب کنترل فرآیند رونویسی ژن های آدنوویروس می شود. این پروتئین با تغییر در عملکرد پروتئین های مهم سلولی از جمله p21 و pRb سبب ایجاد شرایط مساعد برای همانند سازی ژنوم ویروس و ترانسفورم شدن سلول های میزبان می شود. هدف از تحقیق حاضر مهار پایدار بیان ژن E1A در سلول های HEK 293 با استفاده از روش RNAi بوده تا آثار این مهار روی سلول های فوق بررسی شود. مواد و روش ها: ناحیه پروموتر U6 و shRNA از دو پلاسمید اهدایی کنترل و پلاسمید کد کننده siRNA اختصاصی علیه ژن E1A به نام های pSP81-E1A و pSP-81 در پلاسمید pcDNA3.1 ساب کلون شد. سپس سازه های ساخته شده با روش لیپوفکشن به سلول های سرطانی HEK 293 ترانسفکت و کلونی های سلول های ترانسفورم شده بر اساس مقاومت به آنتی بیوتیک نئومایسین انتخاب شدند. تغییرات حاصل از این عمل روی بیان ژن E1A با استفاده از روش RT-PCR بررسی شد. نتایج: بررسی ها نشان گر عدم تفاوت در میزان بیان ژن E1A در پی ترانسفکشن سلول ها با پلاسمیدهای مورد نظر در دو گروه مهار و کنترل بود. برای بررسی احتمال تاثیر روند کلونینگ بر عملکرد پروموتر U6، سلول ها با پلاسمیدهای اهدایی نیز ترانسفکت شدند که مجددا عدم مهار بیان ژن E1A مشاهده شد. نتیجه گیری: نتایج نشان دادند که با وجود تکرار آزمایش هکر مهار قابل توجهی صورت نگرفت. برای کسب اطمینان از صحت توالی ژن E1A، قطعه تکثیر شده در فرآیندPCR ، که شامل ناحیه 13s این ژن است، توالی یابی شد. نتایج حاصل از توالی یابی با وجود جهش در یک نوکلئوتید در ناحیه ای بود که به عنوان هدف برای siRNA انتخاب شده بود. بنابراین می توان علت عدم مهار را به وجود این جهش در ترادف ژن E1A در سلول های استفاده شده در این مطالعه مربوط دانست.