گیاهان وقتی در معرض خشکی و شوری قرار می گیرند با تنش اسمزی مواجه می شوند که برای مقابله با تنش اسمزی ایجاد شده تجمع اسمولیتهایی همچون پرولین، گلیسین بتانین و یا سایر ترکیبات مشابه را افزایش می دهند. در مسیر بیوسنتز این اسمولیتها آنزیمهایی دخالت دارند که بعضی از آنها کلیدی به حساب می آیند و با تغییر در تظاهر ژنهایی که این آنزیمها را کد می کنند می توان فراورده نهایی که اسمولیت مورد نظر می‍‍باشد را افزایش داد. این تحقیق بر روی آنزیم دلتا ـ1ـ پرولین ـ5ـ کربوکسیلات سنتتاز (P5CS ) که یکی از آنزیم های کلیدی در مسیر بیوسنتز پرولین می‍باشد، انجام شد . ابتدا اقدام به ساخت cDNA از روی mRNA حاصل از گیاه ارابیدوپسیس تالیانا (Arabidopsis thaliana) گردید. برای اینکار RNA کل از برگهای گیاه آرابیدوپسیس تالیانا (Arabidopsis thaliana )، که در معرض تنش شوری قرار گرفته بود، استخراج گردید و سپس با استفاده از آنزیم رونویسی معکوس اقدام به ساخت DNA مکمل شد و کل mRNA به cDNA تبدیل گردید و با دو جفت آغازگر اختصاصی به طولهای 27 و 35 نوکلئوتید، و به کمک دستگاه ترموسایکلر، cDNA مربوط به آنزیم P5CS دو رشته ای گردید و تکثیر شد. برای جفت پرایمر به ترتیب در انتهای 5، مکان برشی برای آنزیم های EcoRI و BamHI در نظر گرفته شد تا در همسانه سازی cDNA تکثیر شده مشکلی وجود نداشته باشد. سپس با استفاده از پروب صحت انجام کار به تایید رسید.

آرابیدوپسیس (Arabidopsis thaliana) گیاه مدل مطلوبی جهت مطالعات بیوتکنولوژی می باشد که به وسیله آن در یک دهه گذشته تحولات شگرفی در علوم گیاهی از جمله اصلاح نباتات ایجاد شده است. از جمله کاربردهای این گونه ایجاد جهش یافته های مقاوم به تنش های موجود در محیط و شناسایی و انتقال این صفات به سایر گیاهانی است که فاقد این مقاومت هستند. مقاومت در برابر علف کش ها از جمله صفاتی است که توجه افراد زیادی را به خود جلب کرده است. این تحقیق به منظور بررسی نحوه توارث عوامل مقاومت در برابر یونیکانازل (ماده ای که از تولید جیبرلیک اسید جلوگیری کرده و از این طریق مانع رشد گیاه می شود و می تواند به عنوان علفکش مورد استفاده قرار گیرد.) صورت گرفت. بدین منظور 48 مخزن ژنی متنوع که از طریق انتقال T-DNA به ژنوم اکوتیپ کلمبیا از آرابیدوپسیس ایجاد شده بودند توسط پرفسور Cutler از دانشگاه تورنتو از کانادا در اختیار قرار گرفته و در این تحقیق استفاده شدند تا ژنوتیپ های مقاوم در برابر یونیکانازل شناسایی شوند. دوازده غلظت از یونیکانازل مورد آزمون قرار گرفت تا غلظت بحرانی که در آن بذر اکوتیپ وحشی آرابیدوپسیس قادر به جوانه زنی و رشد نیست شناسایی شود. مخازن ژنی مورد نظر در غلظت بحرانی غربال شدند و تعدادی جهش یافته مقاوم در برابر یونیکانازل شناسایی گردید. به منظور بررسی نحوه توارث صفت مقاومت در یکی از جهش یافته های حاصل و تعداد ژن های کنترل کننده آن، جهش یافته مورد نظر با اکوتیپ های وحشی کلمبیا و لندزبرگ تلاقی داده شد و نسل های F1 و F2 نیز تولید شدند. با آزمون توام والدین و نسل های F1 و F2 در غلظت بحرانی و شمارش نسبت های حاصل مشخص شد که تنها یک ژن غالب این صفت را در جهش یافته مورد نظر کنترل می کند.

دراین تحقیق از TAIL-PCR که در آن از دمای اتصال آغازگر به صورت نامتفارن استفاده می شود جهت تشخیص توالی های نوکلئوتیدی درون و مشرف به T-DNA وارد شده به ژنوم گیاه آرابیدوپسیس استفاده شده است. در این روش توالی های نوکلئوتیدی مرزهای چپ و راست یک T-DNA به عنوان موقعیت نشاندار شده قلمداد گردیده و از دو نوع آغازگر که از نظر طول و دمای اتصال با هم متفاوتند استفاده گردید تا توالی های مورد هدف تکثیر شوند. نوع اول آغازگرهای اختصاصی با طول بلند و دمای اتصال بالا و با سه توالی متفاوت ولی آشیانه ای است که متناظر با توالی های شناخته شده مرزهای چپ و راست  T-DNA است و نوع دوم آغازگرهای اختیاری با طول کوتاه و دمای اتصال پایین تر بودند. چهار موتانت گیاه آرابیدوپسیس  که در اثر وارد شدن T-DNA به ژنومشان به یونیکانازول (ماده ای که از تولید جیبرلین اسید جلوگیری کرده و می تواند به عنوان علف کش استفاده شود) مقاومت نشان داده بودند در این تحقیق مورد استفاده قرار گرفتند. اجرای TAIL-PCR در سه مرحله صورت گرفت که در مرحله دوم و سوم به ترتیب از فرآورده های رقیق شده مراحل اول و دوم به عنوان DNA نمونه یا Template استفاده گردید. در هر مرحله از TAIL-PCR ترکیب پنج آغازگر اختیاری در دو آغازگر اختصاصی مرزهای چپ و راست T-DNA در چهار نمونه DNA از چهار موتانت مورد نظر به کار گرفته می شد به طوری که در هر بار اجرای PCR چهل مخلوط واکنش متفاوت هم زمان تهیه و اجرا می گردید.با مطالعه فرآورده های مراحل دوم و سوم TAIL-PCR روی ژل آگارز دو درصد و مقایسه باندهای مربوط به هر موتانت در دو مرحله، فراورده های اختصاصی از غیر اختصاصی تفکیک شده و با انتخاب باندهای با اندازه مناسب و استفاده از کیت های خالص سازی DNA، نمونه های منتخب خالص سازی و توالی یابی شدند. همخوانی توالی های نوکلئوتیدی حاصل، با مرزهای چپ و راست  T-DNA حاکی است که روش مورد استفاده با دقت کافی موقعیت های نشان دار شده روی ژنوم گیاه را هدف قرار داده و از این جهت روش مطلوبی در تکثیر توالی های نوکلئوتیدی مشرف به T-DNA قلمداد گردید.

پروآنتوسیانیدین ها (Condensed Tannins:CTs)، الیگومرهای فلاونوئیدی می باشند که تعدادی از آنها اثرات مفیدی روی سلامت حیوان و انسان دارند. توانایی پروآنتوسیانیدین ها در تشکیل کمپلکس با پروتئین ها سبب شده که تاثیر زیادی بر ارگانیسم های تجزیه کننده پروتئین و در نهایت کاهش خطر نفخ در حیوانات داشته باشند. آنتوسیانین ها نیز فلاونوئیدهایی هستند که در ایجاد رنگ قرمز، بنفش یا آبی در بذرها و گلها شرکت دارند. ژن BAN حاصل از گیاهArabidopsis thaliana  رمزگردان آنتوسیانیدین ردوکتاز (ANR) می باشد. این آنزیم آنتوسیانیدین ها را به  2,3-cis-flavan-3-ols((+)-catechin) که به عنوان واحد شروع کننده در تشکیل CT شناخته می شوند تبدیل می کند. انتقال این ژن به گیاه یونجه، به منظور القا تولید CT در شاخ و برگ آن جهت استفاده بهینه از پروتئین های گیاه و کاهش خطر نفخ در حیوانات انجام شد. عمل تراریزش ریز نمونه های برگی حاصل از دو لاین یونجه چند ساله با نامهای Rgsy27 و Pl که در حالت عادی دارای مقادیر ناچیز CT در شاخ و برگ می باشند توسط دو نژاد مختلف باکتری (LBA 4404 , EHA 105) Agrobacterium tumefaciens، حامل پلاسمید pBI121. BAN (ناقل دو تایی شامل ژن BAN) صورت گرفت. از ریز نمونه های برگی حاصل از لاین Rgsy27 بیش از 90 درصد تولید کالوسهای پیش جنین زا و از ریز نمونه های برگی حاصل از لاین P1 حدود 30 درصد تولید کالوسهای پیش جنین زا تولید شد. در هر دو لاین بیش از 65 درصد جنین های باززایی شده در مدت دو ماه به گیاه کامل تبدیل شدند. کارایی تراریزش لاین های Rgsy27 و P1 بستگی به نوع نژادهای Agrobacterium tumefaciens مورد استفاده داشت، به نحوی که لاین های تراریخته توسط ژن BAN با نژاد آگروباکتریوم LBA 4404 بهترین واکنش را نسبت به تولید گیاهان تراریخته نسبت به نژاد EHA 105 نشان دادند. تظاهر اکتوپیک ژن BAN در شاخ و برگ گیاه یونجه تراریخته باعث القا تجمع CT شد که به راحتی از طریق بررسی شیمی بافتی قابل تشخیص بود. عدم فعالیت ژن BAN باعث افزایش مقدار رنگدانه قرمز شد. بنابراین این ژن به عنوان تنظیم کننده منفی در تولید رنگدانه ها می باشد. درصد CT در ماده خشک گیاهان تراریخته لاین های Rgsy27 و P1 به ترتیب 0.474 و 0.600 در مقایسه با 0.259 و 0.408 در گیاهان کنترل بود.

الگوی بیان ژن در مراحل ابتدایی جنین زایی بدنی نخود با استفاده از 2,4-D و 2,4,5-T هر یک به غلظت 3 میلی گرم در لیتر در محیط کشت MS مطالعه گردید. تیمار 2,4,5-T ایجاد کالوس های جنین زا و در نهایت جنین کروی نمود، اما در تیمار 2,4-D جنین ظاهر نشد. برای بررسی الگوی جنین زایی حاصل از تاثیر این دو تنظیم کننده رشد، از روش نمایش افتراقی (Differential Display or RAP-PCR) استفاده شد. استخراج mRNA از کالوس های دو تیمار در روزهای 7، 14، 21، 28، 35 و 42 بعد از کشت جنین کامل، صورت گرفت. با استفاده از سه آغازگر الیگو dT لنگردار Dtg، dTA، dTC و واکنش رونویسی معکوس رشته اول cDNA ساخته شد. تکثیر بعدی با استفاده از 8 آغارگر 12 نوکلئوتیدی اختیاری صورت گرفت. جداسازی باندها بر روی ژل پلی اکریلامید واسرشت ساز 6 درصد و دستگاه الکتروفورز عمودی انجام شد. نمایاندن باندها با استفاده از رنگ آمیزی نیترات نقره صورت گرفت و نتایج با استفاده از اسکنر تصویربرداری شد. تمام آغازگرها الگوی بیان ژنی یکنواختی را نشان دادند. در هفته اول و دوم میزان بیان ژن بالا بود و در طی هفته دوم تا چهارم میزان بیان ژن کاهش یافت. از هفته چهارم تا هفته ششم میزان بیان ژن افزایش چشمگیری داشت. هر چند در تمام مراحل آزمایش بین دو تیمار تفاوت هایی مشاهده شد اما در مراحل انتهایی این تفاوت ها بیشتر بود. نتایج نشان دادند اگر چه از نظر زمانی مدت زمان جنین زایی در نخود با گیاهان مدلی نظیر یونجه و آرابیدوپسیس که قبلا مطالعه شده بود، متفاوت بود، ولی از نظر الگوی بیان ژن با آنها مشابهت داشت.

روشهای انتقال ژن مبتنی بر کشت بافت، علاوه بر وقت گیر و پرهزینه بودن، تنوع سوماکلونال در گیاهان تراریخت از دیگر مشکلات استفاده این روشها می باشد. برای حل این مشکلات امروزه علاقه زیادی به بهره گرفتن از روش های انتقال ژن بدون استفاده از کشت بافت وجود دارد که یکی از این روشها بهره گیری از خلا نسبی می باشد. این روش علاوه بر سادگی، کم هزینه بودن و عدم وجود تنوع سوماکلونال، برای گونه های مختلف که سیستم کشت بافت در آنها توسعه نیافته می تواند کاربرد داشته باشد. انتقال ژن با استفاده از این روش اولین بار در گیاه آرابیدوپسیس به کار برده شد و اخیرا کاربرد موفقیت آمیز آن در چند گونه دیگر گیاهی مانند تربچه گزارش شده است. در این پروژه تحقیقاتی برای اولین بار در ایران اقدام به انتقال ژن با روش تلقیح آکروباکتریوم با ایجاد خلا نسبی به گیاه کلزا گردید. همچنین از یک رقم آرابیدوپسیس نیز به عنوان شاهد استفاده شد و فراوانی تراریخت های بدست آمده از گیاه کلزا با این گیاه مقایسه شدند. در این بررسی از دو نژاد اگروباکتریوم EHA101 و C58(pGV3101) حاوی پلاسمید pVW295 که حامل ژنهای مقاومت به کانامایسین (NPTII) و (GUS) است استفاده شد. گیاهان کلزا و آرابیدوپسیس در مرحله گلدهی در داخل دسیکاتور در سوسپانسیون حاوی اگروباکتریوم غوطه ور و به مدت 30-40 ثانیه در خلا -350 تا -400 میلیمتر جیوه تیمار شدند. بذور حاصل از گیاهان تیمار شده با استفاده از محیط کشت انتخابی حاوی 50 و30  میلی گرم در لیتر کانامایسین به ترتیب برای انتخاب گیاهان کلزا و آرابیدوپسیس تراریخت استفاده شد. پس از انتخاب گیاهان مقاوم بر سطح کشت حاوی کانامایسین، سنجش هیستوشیمیایی به منظور بررسی صحت انتقال ژن GUS برروی نتایج انجام شده انجام گرفت. نتیجه آزمایش هیستوشیمیایی صحت انتقال ژن GUS را مورد تایید قرار داد. نتایج حاصل از بررسی بذرهای حاصل از گیاهان تلقیح شده نشان داد که فراوانی گیاهان تراریخت بدست آمده از گیاه آرابیدوپسیس 1.78 برابر گیاه کلزا است . همچنین باکتری نژاد EHA101 کارایی بیشتر نسبت به باکتری نژاد C58(pGV3101) در انتقال ژن به گیاهان آرابیدپسیس و کلزا دارد.

هدف این پژوهش شناسایی ژن های اسید فسفاتاز گیاه آرابیدوپسیس تالیانا قابل القا در شرایط تنش فسفات بوده است. گروه بندی این ژن ها با استفاده از همردیفی چندگانه توالی آمینواسیدی اسید فسفاتازهای موجودات یوکاریوت صورت گرفت. در نتیجه این همردیفی این پروتئین ها به چهار گروه تقسیم شدند که شامل اسید فسفاتازهای بنفش می شود. بر اساس توالی حفظ شده گروه اسید فسفاتازهای بنفش گیاهان، قارچ ها و جانوران آغازگرهای اختصاصی و غیر اختصاصی طراحی شد. بر اساس دو روش نمایش متفاوت، الگوی بیان ژن های اسید فسفاتاز بنفش در ریشه های این گیاه در شرایط تنش و بدون تنش مورد مقایسه قرار گرفت. با بررسی قطعات دارای نمایش متفاوت، 7 کلون cDNA جداسازی شد. بررسی لکه گذاری نوردرن بلات معکوس و واکنش RT-PCR نیمه کمی الگوی ابراز ژن های فوق را در شرایط محیطی مختلف مانند تنش فسفات، غلظت بالای نمک، تنش سرما، تنش سولفور و نیتروژن آشکار ساخت. با استفاده از داده های ارایه شده در این پژوهش برخی نقش های احتمالی این ژن ها در جذب و بازیابی فسفات را می توان پیشنهاد نمود.

برخی گیاهان از طریق تثبیت زیستی قادر به استفاده از نیتروژن هوا هستند. در سویا گره های تثبیت ازت حاصل از اثر متقابل بین Bradyrhizobium japonicum و ریشه است. هر دو موجود در این همزیستی سود می برند: گیاه نیتروژن احیا شده و باکتری قند بدست می آورد تنظیم این همزیستی برای نمو متعادل گیاه ضروری است. مهمترین سازوکار ژنتیکی کنترل گره زایی، خود تنظیمی گره زایی یا AON است. برای بررسی ژن های دخیل در این سازوکار، الگوی بیانی ژن ها در برگ و ریشه نوع وحشی و جهش یافته GmNARK AON یا فوق گره زایی سویا با ریزآرایه افیمتریکس و RT-PCR با زمان واقعی مطالعه شدند. آزمایش های QRT-PCR، نتیجه ریزآرایه برای دو ژن (GmaAffx.32318.1 و Gma5873) تحت کنترل GmNARK را با کاهش بیان در نوع وحشی نسبت به جهش یافته در بافت برگی و با رفتاری مستقل از آلودگی ریزوبیومی تایید کردند. ژن GmaAffx.32318.1 پس از همسانه سازی و تعیین توالی، دارای 80 درصد مشابهت با هترولوگوس ناقل کلسیمی خود در برنج شد. بررسی های QRT-PCR چهار ژن نامزد دیگر نیز موید نتایج ریزآرایه ای آنها گردید و تفاوت معنی داری بین بیان نسبی هر یک از آنها در بافت برگ نوع وحشی و جهش یافته دیده نشد. تجزیه و تحلیل های بیان ژن HMGR1 توسط PCR کمی و ریزآرایه در نواحی خاصی از ریشه گیاهان نوع وحشی و جهش یافته GmNARK، نشان داد که بیان آن می تواند در تنظیم تعداد گره ریشه اهمیت داشته باشد. این ژن پس از گزینش کتابخانه BAC همسانه سازی شد و توالی پروتئین پیش بینی شده آن 85% مشابهت با HMGR1 آرابیدوپسیس داشت. کشف ترکیبات جدید برای چرخه AON موجب افزایش توانایی ما برای جستجو کنترل سیستمیک نمو گیاهی و تلفیق آن با سایر شبکه های پیام رسانی می گردد.