مجله بیوتکنولوژی ایران
سال:1391 | دوره:10 | شماره:2 |تعداد مقالات:8

به منظور افزایش سطح تولید پروتئین های هترولوگ در گیاه، روش های مختلفی نظیر انتخاب پروموترهای اختصاصی اندام یا اندامک، اصلاح رمزهای کد کننده و تعیین جایگاه ویژه سلولی برای تجمع پروتئین هترولوگ استفاده می شود. کلسی تونین (CT) پلی پپتیدی با 32 اسید امنیه است که بازدارنده اختصاصی واجذب استخوان بوده و برای درمان بیماری های مربوط به استخوان در انسان کاربرد دارد. فعالیت کلسی تونین مختص به گونه نیست و از منابع حیوانی گوناگون تولید می شود که مصرف طولانی مدت آن با تشکیل آنتی بادی منجر به کاهش و یا بی اثر شدن فعالیت هورمون می گردد و به همین دلیل کلسی تونین هومولوگ انسانی در درمان های دراز مدت مورد نیاز است. در این تحقیق ژن کلسی تونین انسانی (hCT) با استفاده از پروموتر اختصاصی اندام (GBSSI) granule bound starch synthase I و پروموتر Cauliflower mosaic virus 35S در غده گیاه سیب زمینی تراریخته با واسطه آگروباکتریوم بیان شد. تجزیه و تحلیل مولکولی با استفاده از روش های PCR، RT-PCR، هیبریدیزاسیون نورترن بلات نشان داد که ژن hCT بطور موفقیت آمیزی به گیاه سیب زمینی انتقال یافته و نتایج ایمونواسی نشان داد که بیان اختصاصی در بافت غده سیب زمینی تراریخته منجر به تولید تقریبا پنج برابری و تجمع hCT نسبت به بیان دائمی در تمامی بافت های گیاهی گردیده است.

کلزا (Brassica napus L.) یکی از مهمترین گیاهان زراعی روغنی می باشد. یکی از بیماریهایی که باعث کاهش محصول کلزا می گردد بیماری پوسیدگی ساقه می باشد که توسط قارچ Sclerotinia sclerotiorum ایجاد می شود. پروتئینهای مرتبط با بیماریزایی (PR) توانایی ایجاد مقاومت علیه پاتوژنهای قارچی را دارد. پروتئینهای شبه توماتینی (TLPs) نشان داده اند که دارای فعالیت ضد قارچی علیه طیف وسیعی از پاتوژنهای قارچی می باشند. در این مطالعه ژن tlp جدا شده از گیاه چاودار به گیاه کلزا منتقل شده است. قطعه تکثیر شده (حدود 500 جفت باز) شناسایی و توسط الگوی هضم آنزیمی مورد تایید قرار گرفته و به وکتور pUC19 منتقل گردید. سازه بدست آمده پس از تایید به نام pUCNG1 نامگذاری گردید. مقایسه قطعه کلون شده با ترادفهای DNA موجود نشان می دهد که این ژن بدون اینترون می باشد. ژن tlp پروتئینی با 173 اسید آمینه و وزن ملکولی 17.7 کیلودالتون را کد می نماید. ترادف اسید آمینه ای TLP مورد مطالعه، مشابهت معنی داری را با TLP چاودار و دیگر گیاهان از خود نشان می دهد. برای بررسی فعالیت ضد قارچی این پروتئین، از بیان این پروتئین در گیاه تراریخت کلزا استفاده گردید. بدین منظور سازه حاوی ژن tlp که تحت کنترل پروموتر CaMV35S قرار داشت به Agrobacterium tumefaciens منتقل و با استفاده از الگوی PCR تایید و به ریزنمونه های کوتیلدونی گیاه کلزا واریته R-line Hyola308 منقل گردید. گیاهان تراریخت بدست آمده با استفاده از الگوی PCR و dot blot مورد تایید قرار گرفتند. جهت بررسی مقاومت این گیاهان به قارچ S. sclerotiorum از آزمون detached leaf assay استفاده گردید. اندازه لکه های ایجاد شده توسط قارچ مورد استفاده در برگ گیاهان تراریخت به طور معنی داری نسبت به لکه های ایجاد شده در گیاهان غیرتراریخت کاهش یافته است.

به منظور بررسی بیان پروتئین های القایی تحت تاثیر تابش گاما در باکتری بسیار مقاوم به پرتو، برای اولین بار آنالیز مقایسه ای پروتئوم سوش وحشی باسیلوس مگاتریوم WHO انجام شد. تفاوت در پروفایل پروتئینی باسیلوس مگاتریوم WHO بعد از 5KGy پرتودهی بوسیله الکتروفورز دو بعدی و رنگ آمیزی نقره بررسی شد. اگر چه بیشتر نقاط پروتئینی کاهش بیان را نشان می دادند ولی در این مطالعه نقاط پروتئینی القا شده مورد نظر ما بودند. سطح بیان 48 پروتئین افزایش معنی داری را نشان می داد که از این تعداد 45 پروتئین به وسیله تکنیک انگشت نگاری جرم پپتیدی MALDI TOF-TOF (peptide mass fingerprinting using matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry) بعد از هضم آنزیمی، شناسایی شدند. این پروتئینها انواع اعمال بیولوژیکی جالبی را ارائه می دهند و به گروه های زیر تقسیم می شوند: 1-نسخه برداری 2-ترجمه 3-سیگنال القایی 4-متابولیسم و انتقال کربوهیدراتها 5-تولید انرژی 6-متابولیسم و انتقال نوکلئوتیدها 7-تغییرات بعد از ترجمه، protein turn over وچپرون ها 8- همانند سازی، نوترکیبی و ترمیم -9 DNAپروتئین های مربوط به استرس عمومی در باکتری ها 10-پروتئین هایی که شناخته نشده اند. ظهور چهار نقطه (37، 30، 27، 24) از پروفایل پروتئینی باکتری در مطالعه پیش رو متمایز بود. این پروتئین ها بیان می شوند تا جریان های مربوط به مقاومت به پرتو را میانجیگری کنند و به وضوح نشان دهنده این است که به طور مشخصی باسیلوس مگا تریوم WHO دارای مکانیسم مقاومت به تابش گاما می باشد.

برای تعیین طول قطعات DNA در ژل آگارز یا پلی اکریلامید بطور گسترده از مارکرهای DNA استفاده می گردد. مارکرهای DNA را می توان با مخلوط کردن چندین محصول PCR با طول های مشخص تهیه نمود. شیوه دیگر برای تهیه این مواد، هضم DNA ژنومی باکتریوفاژها یا پلاسمیدهای طبیعی و مصنوعی بوسیله آنزیم های محدودگر می باشد. مطالعه حاضر چگونگی ساخت یک پلاسمید مصنوعی را شرح می دهد که پس از هضم با تنها یک آنزیم محدودگر، موجب تولید مارکر DNA 100bp، یکی از رایجترین انواع مارکرهای DNA می شود. راهکار ما در این مطالعه شامل همسانه سازی پی در پی 10 محصول PCR با طول های 100 تا bp 1000 در پلاسمید pTZ57R، با استفاده از آنزیم های محدودگر BamHI و Bgl II، و آزاد سازی این قطعات از پلاسمید نوترکیب با استفاده از آنزیم EcoRV بود. از این راهکار می توان برای ساخت انواع پلاسمیدهای مصنوعی بمنظور تولید انواع مختلف مارکرهای DNA استفاده نمود.

هدف از این مطالعه، جداسازی و تعیین مشخصات آنزیم پرولین دهیدروژناز از میکروارگانیسم های خاک ایران بود. جداسازی و غربالگری آنزیم های تخریب کننده -Lپرولین از نمونه های خاک انجام شد. جدایه توسط شاخصهای بیوشیمیایی و آنالیز ژن RNA ریبوزومی 16s تعیین مشخصات گردید. پرولین دهیدروژناز هدف تخلیص شد و اثرات pH و دما بر فعالیت و پایداری آزمایش شدند. از میان 150 جدایه های بدست آمده از 30 نمونه خاک، تنها یک جدایه که به عنوان سودوموناس پوتیدا شناسایی شد بالاترین فعالیت آنزیمی را نسبت به -Lپرولین (2200 U/ml) نشان داد. آنزیم مورد نظر به عنوان پرولین دهیدروژناز مشخص گردید و دارای ثابت میکائیلیس-منتن 35 میلی مولار برای -Lپرولین بود. وزن مولکولی پرولین دهیدروژناز خالص سازی شده در حدود 40 کیلو دالتون بود و به عنوان یک پروتئین منومری شناسایی شد. توالیهای آمینواسیدی –Nترمینال زیر واحد آنزیم سودوموناس پوتیدا، MLTSSLTRIIGKSGE بود. پرولین دهیدروژناز فعالیت بالایی در محدوده دمایی 25 تا 35 درجه سانتی گراد نشان داد و بالاترین فعالیت در 30 درجه سانتی گراد بدست آمد. آنزیم در دماهای بین 25 تا 30 درجه سانتی گراد تقریبا به مدت 2 ساعت پایدار بود. pH فعالیت بهینه پرولین دهیدروژناز در pH=8.5 بود و در محدوده 9-pH=8 به مدت 24 ساعت پایدار بود. آنزیم با بازده 8.5 درصد و فاکتور تخلیص 37.7 خالص سازی شد. بطور خلاصه، یک فلاوآنزیم پرولین دهیدروژناز از باکتری سودوموناس پوتیدا تخلیص و تعیین مشخصات گردید. اختصاصیت آنزیم سودوموناس پوتیدا نسبت به پرولین به منظور کاربرد در آنالیز –Lپرولین سودمند می باشد.

یک متالوپروتئاز نوتروفیل از باکتری بنام سودوموناس سویه DR.89 موجود در یک چشمه آب معدنی در ایران، جداسازی شد. با کمک یک روش سه مرحله ای شامل: رسوب دهی با سولفات آمونیوم و کروماتوگرافی های تبادل یونی-Q سفاروز و غربال مولکولی سفادکس G-100، از این سویه، یک آنزیم پروتئاز، به میزان 13 مرتبه خالص سازی گردید. نتایج نشان داد که آنزیم در محدوده وسیعی از pH بین 5-10 مخصوصا pH=8 فعال است. آنالیزهای زیموگرام و الکتروفورز ژل سدیم دودسیل سولفات پلی آکریل آمید (SDS-PAGE)، حضور یک پروتئاز با وزن مولکولی 74 کیلودالتون را نشان داد. فعالیت آنزیم در حضور Zn2+، Mn2+،H2O2  و سیتیل تری متیل آمونیوم بروماید (CTAB)، کاهش نشان داد. درحالی در حضور ترکیبات Ca2+، Mg2+، Cu2+ و دی متیل سولفوکسید (DMSO) فعالیت آنزیم افزایش نشان داد. ترکیبات Na+، فنیل متیل سولفونیل فلورید (PMSF)، بتا-مرکاپتواتانول، سدیم دودسیل سولفات (SDS) و تریتون X-100 اثر قابل توجهی بر فعالیت آنزیم نشان ندادند. کازئین نسبت به آلبومین سرم گاوی (BSA) و ژلاتین، سوبسترای بهتری برای فعالیت آنزیم بود. همچنین، پارامترهای سنتیکی (Km و Vmax) آنزیم نسبت کازئین سنجیده شد. با این خواص، پشنهاد می شود احتمالا بتوان از این آنزیم در صنایع غذایی استفاده کرد.

چند شکلی های ناحیه -5‘کناری ژن پرولاکتین، اگزون های شماره 2 و 5 ژن گیرنده پرولاکتین و ارتباط آن ها با صفات رشد و تولید تخم مرغ در مرغان مولد ایستگاه اصلاح نژاد مرغان بومی مازندران مورد بررسی قرار گرفت. یک چند شکلی تک نوکلئوتیدی (SNP) در جایگاه C-2402-T و یک الحاق 24 جفت بازی در موقعیت 382-در ناحیه -5‘کناری ژن پرولاکتین شناسایی شدند. واکنش PCR همراه با تکنیک RFLP و الکتروفورز مستقیم روی ژل آگارز، برای شناسایی ژنوتیپ های مختلف در جایگاه C-2402-C و یک الحاق حذف 24 جفت بازی در موقعیت 382-ژن پرولاکتین مورد استفاده قرار گرفتند. جایگزینی نوکلئوتید سیتوزین (C) با تیمین (T) و یک الحاق (I) یا حذف (D) در ناحیه پروموتور ژن پرولاکتین باعث ایجاد سه ژنوتیپ به ترتیب با فراوانی های (0.10) CC، (0.84) CT، (0.06) TT و II (0.39)، (0.40) ID و DD (0.21) شد. در اگزون های شماره 2 و 4 ژن گیرنده هورمون پرولاکتین به ترتیب با استفاده از تکنیک های PCR-SSCP وPCR-RFLP ، دو ژنوتیپ(0.54) A/A ، (0.46) B/B و (0.72) AA و (0.28) BB مشاهده شدند و هیچ مرغی با ژنوتیپ هتروزیگوس در این جایگاه ها مشاهده نشد. یک جهش جدید قابل شناسایی با آنزیم برشی BamHI در اگزون شماره 5 ژن گیرنده هورمون پرولاکتین شناسایی شد. نتایج به دست آمده وجود ارتباط معنی داری (P<0.05) را بین SNP اگزون شماره 2 با صفات وزن بدن در هچ و سن در بلوغ جنسی و همچنین بین SNP اگزون شماره 5 با صفت تعداد تخم مرغ تولیدی نشان دادند. افراد دارای ژنوتیپ AA تعداد تخم مرغ بیشتری نسبت به افراد دارای ژنوتیپ BB تولید کردند. نتایج نشان دادند که جایگاه گیرنده هورمون رشد می تواند احتمالا به عنوان یک ژن عمده موثر بر صفات تولیدی در طیور مد نظر قرار گیرد.

هدف از این تحقیق شناسایی چند شکلی ژن های کالپاستاتین، کالپاین در یک گله گوسفند زل با روش های PCR-RFLP و PCR-SSCP بود. در این تحقیق نمونه های خون از 200 راس گوسفند نر و ماده ایستگاه پرورش و اصلاح نژاد گوسفند شیرنگ وافع در شهر فاضل آباد-استان گلستان-خونگیری شد و استخراج DNA به روش بهینه یافته نمکی انجام شد. واکنش زنجیره ای پلیمراز جهت تکثیر یک قطعه 622 جفت بازی شامل اینترون و اگزون اولین دامنه تکراری ژن کالپاستاتین و یک قطعه 190 جفت بازی ژن کالپاین شامل قسمتی از اگزون 5 و 6 و اینترون مابین آن ها انجام گرفت. در تحقیق حاضر چندشکلی ناحیه تکثیر شده ژن کالپاستاتین با هر دو روش فوق بررسی شد. در مورد روش RFLP، قطعه تکثیر شده این ژن، به طور جداگانه توسط دو آنزیم رستریکتاز MspI و NcoI مورد هضم قرار گرفت و دو آلل M و N به ترتیب با فراوانی های 0.855 و 0.145 شناسایی شدند. به کمک روش SSCP، آلل های A،B  و C به ترتیب با فراوانی های 0.835، 0.145 و 0.020 مشاهده گردید. در مورد ژن کالپاین صرفا از روش PCR-SSCP استفاده شد. در نتیجه تک رشته ای کردن ناحیه مورد مطالعه ژن کالپاین با بافر SSCP، آلل های A و B به ترتیب با فراوانی های 0.845 و 0.155 مشاهده گردید. نتایج بدست آمده وجود تعادل هاردی واینبرگ را فقط برای ژن کالپاستاتین با روش SSCP نشان داد (0.05<P) و برای سایر جایگاه ها وجود تعادل هاردی واینبرگ را تایید نکرد (0.05>P). متوسط هتروزیگوسیتی در هر دو جایگاه پایین بود که حاکی از بالا بودن هموزیگوسیتی در گله می باشد. با توجه به وجود چندشکلی در این جایگاه ها و نقش ژن های مذکور در کمیت و کیفیت گوشت به نظر می رسد می توان از اطلاعات بدست آمده برای یافتن ژنوتیپ های موثر بر صفات اقتصادی در گوسفند زل استفاده کرد.