زیست فناوری گیاهان زراعی
سال:1391 | دوره:2 | شماره:3 |تعداد مقالات:8

بیماری ریشه گنایی (رایزومانیا) از مهمترین بیماری های ویروسی چغندرقند می باشد. عامل این بیماری ویروس رگبرگ زرد نکروتیک چغندرقند می باشد. قارچ Polymyxa betae به عنوان تنها ناقل طبیعی این ویروس شناخته شده است. با توجه به ماهیت پارازیت اجباری ناقل و عدم قابلیت کشت در آزمایشگاه، شناسایی گیاهان آلوده معمولا بر اساس مشاهده میکروسکوپی انجام می شود. در این تحقیق به منظور تسهیل در روند شناسایی، آنتی بادی اختصاصی بر علیه این قارچ با استفاده از تکنولوژی پروتئین نوترکیب تولید گردید. پروتئین گلوتاتیون-اس-ترانسفراز (GST) اختصاصی P. betae، به عنوان آنتی ژن جهت تولید آنتی بادی به منظور شناسائی ناقل در گیاهان آلوده استفاده شد. تولید انبوه پروتئین GST بصورت نوترکیب و در میزبان باکتریایی صورت پذیرفت. ابتدا ناحیه کد کننده این پروتئین با استفاده از آغازگرهای اختصاصی و از روی قالب cDNA تهیه گردیده از گیاهان آلوده جداسازی گردید. ژن مزبور سپس به صورت متصل به دنباله شش تایی هیستیدین در ناقل بیانی باکتریایی همسانه سازی گردیده و بیان آن به صورت نوترکیب در باکتری Escherichia coli صورت پذیرفت. خالص سازی پروتئین نوترکیب GST در شرایط طبیعی غیر واسرشتی و با استفاده از روش کروماتوگرافی تمایلی بر روی ستون نیکل انجام گردید. کمیت و کیفیت پروتئین نوترکیب حاصله بر روی ژل پلی اکریلامید بررسی شد. به منظور تولید آنتی بادی، پروتئین نوترکیب GST خالص جهت انجام ایمنی زایی در خرگوش مورد مطالعه قرار گرفت و پس از تهیه آنتی بادی با تیتر بالا، خالص سازی آن با استفاده از ستون پروتئین A صورت گرفت. نتایج آزمایشات سرولوژیکی حاکی از قابلیت بالای آنتی بادی های حاصله جهت شناسایی قارچ ناقل در نمونه های گیاهی آلوده می باشد.

بلایت فوزاریومی سنبله بیماری است که باعث خسارت شدید اقتصادی در مزارع گندم و سایر غلات دانه ریز در نقاط مختلف دنیا می شود. آلودگی غذاهای حاصل از غلات آلوده با میکوتوکسین تریکوتسنی دی اکسی نیوالنول (DON) که توسط قارچ Fusarium graminearum تولید می شود، خطر شدیدی برای سلامت انسان ها و حیوانات است زیرا تریکوتسن ها می توانند باعث مرگ سلول های یوکاریوتی شوند. تریکوتسن ها با هدف قراردادن پروتئین ریبوزومی L3 در مرکز پپتیدیل ترانسفراز از ترجمه پروتئین ها جلوگیری می کنند. در این مطالعه، ما cDNA کدکننده پروتئین ریبوزومی RPL3 از گیاه گوجه فرنگی (Lycopersicon esculentum) را تغییر دادیم به طوری که اسیدآمینه 258 از تریپتوفان به سیستئین و اسیدآمینه 259 از هیستیدین به تیروزین تغییر کند. ژن دارای جهش دوگانه و ژن طبیعی پروتئین ریبوزومی L3 به سویه حساس به DON (فاقد ژن های pdr5 و ayt1) مخمر Saccharomyces cerevisiae منتقل شدند. مخمرهای دارای RPL3 جهش یافته نسبت به مخمرهای دارای ژن طبیعی همین پروتئین در محیط کشت دارای DON از قدرت زنده مانی و سرعت رشد بیشتری برخوردار بودند. یافته های فوق می تواند زمینه های نوینی را در راستای توسعه ارقام مقاوم گندم به بلایت فوزاریومی سنبله از طریق دست ورزی های ژنتیکی ایجاد نماید.

ویروس موزائیک کوتولگی ذرت (Maize dwarf mosaic virus, MDMV)یکی از مهم ترین و گسترده ترین ویروس های ذرت در دنیا می باشد. تحقیق حاضر به منظور مقایسه خصوصیات مولکولی و آنالیز ترادف نوکلئوتیدی نواحی کد کننده پروتئین های موجود در ناحیه 5’ ژنوم ویروس موزاییک کوتولگی ذرت و مقایسه آن با سایر جدایه های این ویروس و نیز سایر پوتی ویروس های غلات انجام گردید. بدین منظور گیاهان ذرت با علائم موزاییک و کوتولگی از استان گلستان جمع آوری شد. پس از تعیین آلودگی در آزمون الایزای غیرمستقیم با آنتی سرم اختصاصی MDMV یک نمونه آلوده جهت استخراج RNAی کل انتخاب شد. جهت تکثیر ناحیه 5’ ژنوم ویروس از 5 جفت آغازگر اختصاصی استفاده شد که 5 قطعه همپوشان شامل 5’-UTR، p1، HC-Pro، P3 و 6K1 به اندازه کل 3460 جفت باز به دست آمد. آنالیزهای مقایسه ای ترادف نوکلئوتیدی این ناحیه از ژنوم MDMV نشان داد که جدایه ایران (گلستان) به ترتیب دارای شباهت 95.7 و 92.3 درصد در سطح آمینواسیدی 90.5 و 85.1 و درصد در سطح نوکلئوتیدی با جدایه های بلغارستان و اسپانیا است و در مقایسه با سایر ویروس های آلوده کننده غلات هم گروه با MDMV بیشترین شباهت با ویروس موزاییک سورگوم از تگزاس و ویروس موزاییک نیشکر از چین به ترتیب با 72.9 و 72.3 درصد به دست آمد.

در این تحقیق، یک جمعیت F2:3 حاصل از تلاقی دو رقم جوی Hiberna و Pfyner جهت تعیین نحوه توارث به روش تجزیه میانگین نسل ها و همچنین شناسایی نواحی ژنومی (QTL) کنترل کننده عملکرد و اجزاء آن از طریق نشانگرهای ریزماهواره، مورد استفاده قرار گرفت. تجزیه میانگین نسل ها نشان داد که اگرچه در کنترل اکثر صفات زراعی هر دوی اثرات افزایشی و غالبیت نقش داشتند، اثرات غالبیت و اثرات متقابل غیرآللی بیشترین سهم را در توارث صفات روز تا رسیدگی، تعداد دانه در خوشه، طول خوشه و ارتفاع بوته به خود اختصاص دادند. پارامترهای ژنتیکی نظیر وراثت پذیری نشان داد که اداره صفت تعداد پنجه تحت تاثیر اثرات افزایشی بود. با اینکه اثرات افزایشی مهم ترین نقش را در تکوین صفت عملکرد دانه در بوته داشتند این صفت از وارثت پذیری قابل توجهی برخوردار نبود. نقشه پیوستگی 159 نشانگر ریزماهواره با پوشش ژنومی 1030.5 سانتی مورگان تهیه گردید. بر اساس روش مکان یابی فاصله ای مرکب برای صفات روز تا رسیدگی، تعداد پنجه، وزن هزار دانه، ارتفاع بوته، طول خوشه، تعداد دانه در خوشه و عملکرد دانه به ترتیب 2، 4، 2، 4، 1، 4 و 7 ناحیه ژنومی مکان یابی شد. در میان QTL های شناسایی شده در این مطالعه 10 ناحیه ژنومی توسط سایر محققین گزارش شده بود، که این امر نشان دهنده اهمیت و پایداری این نواحی در جمعیت های مختلف است. نتایج این تحقیق همچنین نشان داد که صفت عملکرد دانه تحت تاثیر تعداد زیادی ژن کوچک اثر بود، که این امر گزینش مستقیم برای اصلاح این صفت را با مشکل مواجه خواهد کرد. دو QTL از والد ‘Pfyner’ بر روی کروموزوم های 1H و 2H (qgs-1 و qnt-2a) شناسایی شد که بصورت معنی دار باعث افزایش تعداد دانه در خوشه و تعداد پنجه شدند. در نتیجه در جمعیت در حال تفرق مورد بررسی می توان از این نواحی ژنومی به عنوان شاخص های گزینشی مناسب برای اصلاح غیرمستقیم عملکرد استفاده کرد.

امروزه استفاده از قابلیت های کشت سلولی برای تولید مواد موثره دارویی بسیار مورد توجه است. ترکیبات فلورسانس در بسیاری از زمینه ها مانند محیط زیست، صنایع غذایی و پزشکی ارزشمند می باشند. در این پژوهش کشت سوسپانسیون سلولی زیره سیاه، به عنوان یک گیاه دارویی مهم در ایران، در محیط کشت MS مایع حاوی 2 میلی گرم در لیتر NAA و 0.5 میلی گرم در لیتر BA استقرار یافت. برای جداسازی و خالص سازی ترکیب فلورسانس موجود در سلول های کشت سوسپانسیون، مقدار 100 گرم سلول خشک را با 100 میلی لیتر دی کلرومتان عصاره گیری کرده و سپس از ستون کروماتوگرافی و روش Preparative TLC برای خالص سازی آن استفاده شد. از مخلوط دو حلال دی کلرومتان و متانول با نسبت 1:9 به عنوان فاز متحرک استفاده گردید. نتایج TLC عصاره های تهیه شده از اندام های مختلف گیاه (بذر، ساقه، برگ، ریشه و بذر) و سلول های کشت سوسپانسیون زیر نور UV با طول موج 365 نانومتر نشان داد که یک ترکیب فلورسانس آبیرنگ در اندام ریشه و سلول های کشت سوسپانسیون وجود دارد که در اندام های هوایی گیاه دیده نمی شود. همچنین در شرایط کاملا یکسان مقدار این ترکیب در بافت کالوس کمتر از سلول می باشد و مقداری از این ترکیب فلورسانس به درون محیط کشت مایع آزاد می شود. به منظور شناسایی این ترکیب از روش رزونانس مغناطیسی هسته استفاده گردید و نتایج آن نشان داد که این ترکیب یکی از مشتقات کومارین (6- متوکسی 7- هیدروکسی کومارین) است. افزودهشدن گروه های متیل و هیدروکسی به ساختار کومارین سبب ایجاد ویژگی فلورسانسی در آن می شود.

مکان یابی ژن های کمی (QTL) برای 10 صفت مربوط به کیفیت پخت و خوراک برنج با استفاده از 144 لاین نوترکیب خویش آمیخته حاصل از تلاقی دو رقم هاشمی/نعمت توسط نشانگر ریزماهواره انجام شد. صفات مورد بررسی در این تحقیق شامل میزان آمیلوز، درجه حرارت ژلاتینی شدن و هشت خصوصیت چسبندگی نشاسته دانه برنج بود. در مجموع تعداد 23 عدد QTLs برای 10 صفت مورد بررسی از حداقل یک QTL تا حداکثر 4 QTL برای هر صفت شناسایی شد. برای هر صفت حداقل یک QTL روی کروموزم 6 شناسایی شد. چندین کلاستر ژنی که هر کدام از این کلاسترها چند صفت را کنترل می کنند نیز شناسایی شد. خصوصا یک کلاستر ژنی در نزدیکی جایگاه ژن آلکالین روی کروموزم 6 که شامل چهار QTL (qGT6، qFV6b، AcSV6 و QSBV) بود که به ترتیب صفات درجه حرارت ژلاتینی شدن، چسبندگی نهایی، قوام و پسروی چسبندگی را کنترل می کنند. اغلب این QTLها بزرگ اثر بودند. یک کلاستر ژنی مهم دیگر در مکان ژنی واکسی روی کروموزوم 6 قرار داشت و شامل QTL 3 (qAC6، qMV6a و qBDV6) که به ترتیب صفات میزان آمیلوز، حداقل چسبندگی و فروریختگی چسبندگی را کنترل می کنند، که این  QTLها نیز بزرگ اثر بودند. نتایج این تحقیق نشان داد که برخی از صفات مربوط به کیفیت پخت و خوراک برنج توسط دو ناحیه ژن واکسی و آلکالین روی کروموزم 6 کنترل می شود. همچنین QTL های کوچک اثر جدیدی روی سایر کروموزوم ها برای صفات مورد بررسی شناسایی شد.

کشت میکروسپور یکی از روش های کارآمد تولید گیاهان هاپلوئید میباشد. در پژوهش حاضر، سیستم کشت میکروسپور در دو رقم تتراپلوئید رز (‘Apollo و ‘Amarosa’) مورد بررسی قرار گرفت. عواملی شامل محیط جداسازی میکروسپورها (AB و B)، محیط القای جنینزایی در میکروسپورها (AT3) به همراه منابع مختلف کربوهیدرات (ساکارز، مالتوز یا گلوکز) و آمینواسید لاکتالبومین هیدرولیزات مورد مطالعه قرار گرفتند. اثر تنش های گرسنگی و دمایی به تنهایی و یا به صورت توام با مدت زمان های گوناگون بر تقسیمات متقارن (اسپروفیتی) مورد ارزیابی قرار گرفت. از میکروسپورها در مراحل مختلف نموی جهت کشت استفاده شد اما بیشتر آن ها در مرحله انتهای تک سلولی بودند. به منظور حذف آلودگی های باکتریایی و قارچی، غنچه ها قبل از کشت با اتانول 70 درصد به مدت 15، 30 و 60 ثانیه یا هیپوکلریت سدیم (3.5 درصد) به مدت 5، 10 و 15 دقیقه ضدعفونی سطحی شدند. بهترین روش ضدعفونی غنچه ها تیمار با هیپوکلریت سدیم (3.5 درصد) به مدت 10 دقیقه تشخیص داده شد. دو محیط جداسازی تفاوت معنی داری در زنده مانی میکروسپورها نشان ندادند. در میان محیط های القایی مورد بررسی، در رقم‘Amarosa’، بالاترین میزان زنده مانی میکروسپورها در محیط AT3 به همراه قند گلوکز به دست آمد. محیط های کشت القایی در رقم‘Apollo’، تفاوت معنی داری در زنده مانی میکروسپورها نشان ندادند. ترکیبی از تنش های گرسنگی و سرمایی به مدت سه روز موجب القای جنین در رقم ‘Amarosa’ گردید. در پژوهش حاضر برای اولین بار جنین زایی میکروسپورهای رز گزارش می گردد.

یکی از مکانیسم هایی که در جهت کاهش تاثیرات توکسین داکسی نیوالنون DON شناسایی شده، دست ورزی جایگاه هدف آن پروتئین ریبوزومی (RPL3) L3 می باشد. در این پژوهش دو تغییر نقطه ای (اسیدآمینه شماره 258 از تریپتوفان به سیستئین و شماره 259 از هیستیدین به تیروزین) در توالی cDNA ژن RPL3 گوجه فرنگی با استفاده از تکنیک جهش زایی با جایگاه مشخص (SDM) انجام پذیرفت. گیاه مدل توتون تراریخت با  LeRPL3ی دست ورزی شده از نظر توانایی باززایی و تولید کالوس در حضور توکسین DON مورد آزمایش قرار گرفت. تفاوت های قابل توجهی از نظر توانایی تولید کالوس و باززایی در حضور DON در لاین های تراریخت در مقایسه با شاهد غیرتراریخت مشاهده گردید. در بین جهش های منفرد، در گیاهان حاوی LeRPL3H259Y پاسخ مقاومت به DON بهتری از خود نشان دادند. نتایج نشان می دهد که بیان AYT1 و پروتئین RPL3 دست ورزی شده می توانند در القای تحمل به DON و به دنبال آن افزایش مقاومت به بیماری FHB در گیاهان میزبان موثر باشند.