مهندسی ژنتیک و ایمنی زیستی
سال:1397 | دوره:7 | شماره:1 |تعداد مقالات:10

ویروس پیچیدگی برگ زرد گوجه فرنگی (Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV) از مهمترین بیمارگرهای مناطق گرمسیری و نیمه گرمسیری است. طی سال های 1396-1395، تعداد 393 نمونه گوجه فرنگی دارای علائم بیماری پیچیدگی برگ زرد گوجه فرنگی از شش استان مختلف عراق جمع آوری شد. در آزمون ساندویچ دوطرفه الایزا (DAS-ELSA)، 55 نمونه (14 درصد) با آنتی بادی های اختصاصی TYLCV واکنش مثبت نشان داد. پس از استخراج دی. ان. ا کل، آلودگی 21 (از 55) نمونه با واکنش مثبت در الایزا به TYLCV با واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) تایید و ژن پروتئین پوششی V1 16جدایه از ویروس با استفاده از جفت آغازگر اختصاصی تکثیر، همسانه سازی و تعیین ترادف شد. براساس همردیف سازی ترادف نوکلئوتیدی، بالاترین میزان یکسانی نوکلئوتیدی ژن پروتئین پوششی این جدایه ها (6/99-1/94 درصد) با جدایه های این ویروس از کویت (KJ830841) و عراق (JQ354991) تعیین شد. در تحلیل تبارزایی براساس ترادف نوکلئوتیدی V1، جدایه های عراق، بدون ارتباط با منشا جغرافیایی، در دو گروه و چهار زیرگروه قرار گرفتند. شاخص های تنوع ژنتیکی براساس این ناحیه ژنومی ویروس حاکی از وجود تنوع ژنتیکی زیاد در زیرجمعیت های عراقی بود. نسبت جانشینی های نامترادف به جانشینی های مترادف Pi(a)/Pi(s) کمتر از یک (1>) این ژن، نشان دهنده تاثیر فشار انتخابی منفی روی آن می باشد. همچنین جریان ژنی کمی بین دو زیرجمعیت مرکزی و جنوبی عراق تعیین شد که نشان دهنده تمایز ژنتیکی جدایه ها در این نواحی از کشور می باشد. این مطالعه اولین پژوهش در خصوص بررسی پراکنش جغرافیایی و تنوع ژنتیکی TYLCV در عراق می باشد. تعیین ترادف نوکلئوتیدی ژنوم کامل جدایه ها به منظور تعیین سویه ویروس ضروری می باشد.

شب پره پشت الماسی یا بید کلم Plutella xylostella L. در برابر بسیاری از آفتکش ها از جمله پایرتروئیدها مقاومت توسعه یافته ای نشان داده است. در تحقیق حاضر سمیت دلتامترین روی لارو سن سوم شش جمعیت از این حشره با استفاده از روش غوطه ور سازی برگ بررسی شد. نتایج نشان داد که جمعیت های مختلف این حشره حساسیت متفاوتی در برابر دلتامترین دارند. جمعیت های مقاوم شب پره پشت الماسی با استفاده از فشار گزینشی طی 15 نسل در شرایط آزمایشگاه به وجود آمدند و حساسیت آنها به دلتامترین مورد ارزیابی قرار گرفت. در این جمعیت های مقاوم نسبت مقاومت به طور قابل توجهی افزایش پیدا کرد. اگرچه سینرژیست های DEM وTPP هیچ نوع اثر سینرژیستی روی دلتامترین نداشتند، سینرژیستPBO به طور قابل توجهی سمیت دلتامترین در جمعیت های مقاوم را کاهش داد. سینرژیست DEF نیز اثر سینرژیستی نسبتا خوبی داشت. مطالعات آنزیمی نشان دادند که فعالیت آنزیم های مونواکسیژناز و استراز در جمعیت های مقاوم بسیار بیشتر از فعالیت آنزیم گلوتاتیون اس-ترانسفراز می باشد. در بررسی مقاومت تقاطعی، نتایج نشان داد که جمعیت بسیار مقاوم شب پره پشت الماسی در برابر حشره کش های هگزافلومورون و ایندوکساکارب مقاومت تقاطعی بالایی را نشان می دهد همچنین در این جمعیت هیچ نوع مقاومت تقاطعی با حشره کش آبامکتین دیده نشد.

ژن های شبه استریکتوسیدین سینتاز (SSL) از خانواده های ژنی موجود در ژنوم آرابیدوپسیس هستند. اورتولوگ های این خانواده در سایر گیاهان نظیر پریوش (Catharanthus roseus) آنزیم های کلیدی مسیر بیوسنتز ایندول آلکالوئیدهای مونوترپنوئیدی هستند. ژن SSL6 آرابیدوپسیس، از اعضاء خانواده ژنی SSL، در پاسخ به انواع تنش ها و مولکول های پیام رسان به صورت معنی-داری القاء می شود. در این مطالعه، از روش های ژنتیک معکوس (درج T-DNA) برای تعیین نقش کارکردی ژن SSL6 در پاسخ به تنش شوری استفاده شد. آزمایش به صورت فاکتوریل در قالب طرح کامل تصادفی با دو فاکتور و در سه تکرار انجام شد. فاکتورها شامل دو ژنوتیپ (Col-0 و ssl6) و سه سطح تیمار NaCl (0 mM, 100 mM, 200 mM) بود. در مقایسه با گیاه تیپ وحشی، افزایش تجمع پرولین و محتوای آنتوسیانین و کاهش محتوای مالون دی آلدئید (MDA) در پاسخ به تنش شوری معنی دار بود. بررسی Real Time-PCR مشخص کرد که افزایش بیان ژن های SOS در پاسخ به تیمار شوری 150 میلی مولار NaCl در زمان های 3 و 6 ساعت پس از تیمار در گیاهssl6 در مقایسه با Col-0 معنی دار است. در مجموع این نتایج نشان داد که احتمالاً ژن SSL6 نقش کنترل کننده منفی در پاسخ به تنش شوری در گیاه آرابیدوپسیس بر عهده دارد.

عروسک پشت پرده (Physalis alkekengi L. ) یک گیاه دارویی از تیره Solanaceae و غنی از مواد فیتوشیمیایی از قبیل فیزالین ها، ویتانولیدها، استرول ها، پلی ساکاریدها و فلاوونوئیدها است. این گیاه دارویی کاربردهای زیادی در طب سنتی و صنعت داروسازی دارد. کشت ریشه های مویین عروسک پشت پرده می تواند یک روش کارآمد برای تولید صنعتی متابولیت های ثانویه آن باشد. در این پژوهش برای القای ریشه مویین در عروسک پشت پرده اثر پنج سویه Agrobacterium rhizogenes شامل GM، C58، A4، MSU و 15834 و ریزنمونه های برگ و ساقه مطالعه شد. بیشترین درصد تراریختی مربوط-به ریزنمونه های تلقیح شده با سویه های A4، MSU و 15834 بود. ریزنمونه های برگ با تولید 5/6 ریشه مویین به ازای هر ریزنمونه نسبت به ریزنمونه های ساقه (2/9 ریشه مویین به ازای هر ریزنمونه) عملکرد بهتری داشتند. برای تأیید تراریخته بودن ریشه های مویین، پس از استخراج DNA، PCR با جفت آغازگر اختصاصی rol A انجام شد. الکتروفورز محصولات PCR حضور قطعه 403 جفت بازی rol A در ریشه های مویین و تراریخته بودن آن ها را تأیید کرد. پژوهش حاضر اولین مطالعه منتشر شده در زمینه القای ریشه مویین درP. alkekengi است.

کلزا یکی از با اهمیت ترین دانه های روغنی جهان به شمار می رود. علف های هرز یکی از مهمترین عوامل تهدید کننده کشت کلزا (Brassica napus) است. گلایفوسیت علف کشی عمومی، آنزیم EPSPS را مهار می کند. یکی از موثر ترین راه های ایجاد گیاهان مقاوم به گلایفوسیت، انتقال ژن کد کننده آنزیم EPSPS است. در پژوهش حاضر، یک جهش سه نقطه ای در ژن aroA باکتری E. coli ایجاد کرده سپس ژن مورد نظر را به همراه یک نسخه ژن معمولی در پلاسمیدهای pUC18 و pBI121 کلون کرده و توسط باکتری خاکزی Agrobacterium tumefaciense، سویه LBA4404، به سلول های گیاه کلزا رقم بهاره RGS003 انتقال داده شد. ژن مورد نظر تحت کنترل پروموتور CaMV35Sو ترمیناتور NOS بود. کلون سازی ژن در ناقل های کلونی و بیانی، بررسی تراریختی از طریق PCR و سایر آزمایش های مولکولی جهت تائید انجام گرفت. در این تحقیق در نسل T1 از 142 لاین مستقل تراریخته برای تیمار گلایفوست استفاده گردید که از این تعداد 10 لاین برای آزمونهای بعدی در نسل T2 مورد استفاده گردید. بذور گیاهان تراریخته نسل T2 در دو شرایط in vivo و in vitroبه صورت آزمایش فاکتوریل در غلظت های مختلف علفکش گلایفوسیت مورد بررسی قرار گرفتند. سپس درصد سوختگی و برخی صفات مرفولوژیک مانند ارتفاع بوته، تعداد شاخه ی فرعی و تعداد غلاف در بوته اندازگیری شد. نتایج نشان داد که گیاهان تراریخته می توانند تا غلظت 8/76 میلی مولار از علفکش گلایفوسیت را تحمل کنند؛ در حالی که گیاه شاهد در غلظت های صفر، 2/1، 4/2 میلی مولار قدرت زنده مانی دارند.

بیماری پوسیدگی فوزاریومی ریشه لوبیا توسط بیمارگر خاکزی f. sp. phaseoliFusarium solani ایجاد می شود و خسارت فراوان در مزارع لوبیا دنیا و ایران ایجاد می کند. در حال حاضر مهمترین و اقتصادی ترین روش کنترل این بیماری استفاده از ارقام مقاوم می باشد. برای این منظور در این تحقیق عکس العمل پنج رقم رایج کشت و 14 لاین لوبیا سفید به قارچ عامل بیماری پوسیدگی فوزاریومی ریشه لوبیا ابتدا به صورت ارزیابی مورفولوژیک و سپس کمیت سنجی باReal time PCR انجام شد. بر اساس نتایج ارزیابی مورفولوژیک لاین KBC43106 و رقم درسا به ترتیب حساس و متحمل شناخته شدند، سپس به منظور ارزیابی کمی و روند رشد قارچ عامل بیماری در لاین حساس و رقم متحمل گیاهچه های دو برگچه ای با غلظت 107 اسپور در میلی لیتر قارچ عامل بیماری به روش فرو بردن ریشه (Root dip) تلقیح گردیدند و در فواصل زمانی صفر، 2، 7، 15، 21 و 30 روز پس از آلودگی از ریشه گیاهچه های تلقیح شده و شاهد نمونه برداری و استخراج DNA از آنها انجام شد. روند افزایش تدریجی میزان DNA قارچ موجود در ریشه ها با استفاده از تکنیک Real time PCR و به کارگیری سیستم SYBR Green همراه با آغازگرهای اختصاصی برای ژن elongation factor 1-α کمیت سنجی گردید. نتایج نشان داد تفاوت معنی داری بین مقدار DNA بیمارگر در ریشه گیاهان حساس و متحمل وجود دارد و بنابراین تکنیک Real time PCR، تکنیک مناسبی برای ارزیابی مقاومت ارقام و لاین های لوبیا می باشد.

یکی از مؤثرترین راه های ایجاد گیاهان مقاوم به علفکش گلایفوسیت، دستورزی ژن کد کننده آنزیم EPSPS به منظور کاهش میل ترکیبی گلایفوسیت به این آنزیم است. EPSPS از آنزیم هایمسیر شیکیمات بوده که مسئول ساخت اسیدهای آمینه حلقوی و نیز انواع متابولیت های ثانویه در گیاهان و باکتری ها است. بدون حضور آنزیم فوق، موجود قادر به ادامه حیات نخواهد بود. در تحقیق حاضر یکی ازدومین های مهم جهت اتصال آنزیم EPSPS که اسیدآمینه گلایسین 96 است، به روش جهش زایی نقطه ای به واسطه مگاپرایمر در تک تیوپ از واکنش PCR به اسیدآمینه آلانین تغییر داده شد. ژن تغییر یافته (EPSPS)، به همراه ژن تیپ وحشی (35S: EPSPS) جداگانه در وکتور بیانی pPZPY122 کلون و به واسطه سویه سوپربیماریزای EHA105 ازAgrobacterium tumefaciens به جنین بالغ گیاه برنج (Oryza sativa L. ) در رقم هاشمی به روشin planta انتقال یافتند. تأیید مولکولی تراریزش در دو نسل از گیاهان برنج به روش PCR انجام شد. همچنین تأیید فنوتیپی بر اساس مقاومت به آنتی بیوتیک جنتامایسین و نیز مقاومت به علفکش گلایفوسیت در غلظت های مختلف انجام شد. در نهایت بررسی مقدار بیان ژن های انتقال یافته در نسل دوم به واسطه qPCR انجام شد. نتایج نشان دهنده بیان هر دو ژن در گیاهان مورد آزمایش بود. در این مطالعه مشخص شد که فرابیان ژن موتانت سبب تولید گیاهان با مقاومت بالاتر به علفکش در مقایسه با گیاهان شاهد غیرموتانت و همچنین گیاهان با فرابیان ژن وحشی شده است.

ویروس برگ باد بزنی مو (Grapevine fanleaf virus, GFLV) در تاکستان های مناطق مختلف دنیا شیوع دارد. علایم ایجاد شده توسط این ویروس اغلب در سه سندرم برگ بادبزنی، موزاییک زرد و رگ نواری تقسیم بندی شده اند که علت تفاوت در ایجاد علایم به تنوع ژنتیکی جدایه ها نسبت داده شده است. از این رو در این تحقیق تنوع ژنتیکی GFLV 2AHP بویژه در جدایه های همراه با علایم زردی بررسی شد. نمونه ها از تاکستان های بناب، روستای شیرامین، حسین آباد قزوین و تبریز جمع آوری و ژن 2AHP در 11 جدایه تکثیر، همسانه سازی و تعیین ترادف شد. این ژن در سطح نوکلوتیدی و امینواسیدی به ترتیب 27-8/0 و 35-8/0 درصد تنوع داشت که نشانگر تنوع بیشتر در سطح آمینواسیدی نسبت به اسیدهای نوکلئیک است. نتایج آزمون نوترکیبی بر وجود نقطه داغ برای نوترکیبی را تایید نمود. فشار انتخابی این ژن در تمامی بخش های آن یکسان نبوده به طوری که انتهای آمینی 2AHPمتناظر با نوکلئوتیدهای 564-408 بیشتر از 1 بود. وجود جهش های نقطه ای که منجر به تغییر امینواسیدها شده اند به همراه نوترکیبی می توانند تنوع بیشتر اسیدآمینه ها در مقایسه با نوکلئوتیدها را در این ناحیه ژنی توجیه کنند.

از آنجایی که روش های تولید آنتی بادی برای کاربرد در ویروس ها دارای محدودیت هایی می باشد، بیان پروتئین پوششی در سیستم پروکاریوتی به منظور تولید آنتی ژن انجام می شود. در پژوهش حاضر ژن نوکلئوکپسید ویروس پژمردگی لکه ای گوجه فرنگی از یک جدایه بومی در ایران تکثیر شده و پس از همسانه سازی، قطعه مربوط به ژن نوکلئوکپسید در سازه pTG19TSWV-N با آنزیم-هایBamHI و XhoI خارج شد و در حامل بیانی pET32a(+) برش یافته با آنزیم های BamHI وXhoI همسانه سازی شد. سپس، سازه pET32TSWV-N به سویه های BL21(DE3) وBL21(DE3) pLysS از باکتری E. coli انتقال یافت. بیان ژن نوکلئوکپسید با استفاده از القای پیشبر با غلظت یک میلی مولار IPTG در هر دو سویه صورت گرفت. چهار ساعت پس از القا، محیط های کشت باکتریایی جمع آوری شدند و محتوای پروتئینی استخراج شده از دو سویه مذکور در الکتروفورز عمودی بررسی شدند. با توجه به وزن مولکولی پروتئین بیان شده به همراه برچسب هایی که از پلاسمید به پروتئین اضافه شده بود، پروتئینی به اندازه حدود 48 کیلودالتون در الکتروفورز عمودی مشاهده شد. نتایج این تحقیق حاکی از بیان ژن نوکلئوکپسید در دو سویه مذکور بود در حالیکه بیان پروتئین در سویه باکتریایی BL21(DE3) pLysS نسبت به BL21(DE3) بیشتر بود.

اگرچه کشاورزی تامین کننده نیاز در حال رشد مواد غذایی و سایر محصولات است، اما در عین حال یکی از عوامل اصلی انتشار گازهای گلخانه ای، از بین رفتن تنوع زیستی، آلودگی های شیمیایی، و تخریب خاک است. نگرانی ها در مورد پایداری کشاورزی سنتی توجهات را به سمت سیستم های کشاورزی جایگزین همانند کشت ارگانیک و محصولات تراریخته که بیشتر با محیط زیست سازگار می باشند معطوف ساخته است. بررسی منابع و تجزیه و تحلیل های آماری مختلف نشان داده اند که اگر چه کشاورزی ارگانیک در مقایسه با کشاورزی سنتی دارای عملکرد کمتری است اما مواد با ارزش مغذی برابر یا بالاتر به همراه بقایای کمتر آفت کش یا عدم وجود آن ارائه می کند. از طرف دیگر در محل خسارت آفات یا بیماری ها در محصول ارگانیک ممکن است مقدار زیادی قارچ های ساپروفیت رشد نمایند که مایکوتوکسین های سمی و سرطان زا ایجاد کند. بنابراین و به منظور تولید غذای کافی با قیمت مناسب برای جمعیت در حال ازدیاد در جهان که پیش بینی می شود تا سال 2030 به 7 میلیارد نفر خواهد رسید و به منظور تامین معیشت کشاورزان به خصوص کشاورزان خرده پا و کم درآمد و همچنین کاهش تاثیرات زیست محیطی ناشی از فعالیت های کشاورزی، تلفیقی از روشهای قدیم و نوین در کشاورزی و استفاده از علوم و فنون نوین به ویژه محصولات تراریخته می تواند راه گشای بسیاری از مشکلات غذایی و زیست محیطی در جهان باشد. گیاهان تراریخته مقاوم به آفات و بیماری ها می توانند در کشاورزی تلفیقی و ارگانیک در جهت کاهش مصرف سموم به کار روند. کشت محصولات تراریخته با اهداف کشاورزی ارگانیک از جمله کاهش یا عدم مصرف سم همسو است. از این روست که اصطلاح "ارگانوژنیک" تعریف می شود که از پیوند مبارک محصولات ارگانیک و محصولات تراریخته به وجود می آید.