مهندسی ژنتیک و ایمنی زیستی
سال:1398 | دوره:8 | شماره:1 |تعداد مقالات:10

گوجه فرنگی (Solanum lycopersicum) یکی از مهم ترین سبزی ها در جهان است که طیف وسیعی از پاتوژن ها و آفات گیاهی به این گیاه حمله می کنند. یکی از مهم ترین این آفات، لارو هلیوتیس است که عمدتاً به میوه و برگ خسارت زده و باعث کاهش محصول می شود. ﺩ ﺭ ﺍ ﻳ ﻦ ﭘ ﮋ ﻭ ﻫ ﺶ ﺗ ﺮ ﻛ ﻴ ﺐ ﺳ ﺎ ﺯ ﻩ ژﻧ ﻲ cry1a105 تحت راه انداز دائمی CaMV 35S و خاتمه دهنده NOS ﺩ ﺭ ناقل pBI121 همسانه سازی ﺷ ﺪ ﻩ ﻭ ﺑ ﻪ ﺍ ﮔ ﺮ ﻭ ﺑ ﺎ ﻛ ﺘ ﺮ ﻳ ﻮ ﻡ تومفاسینس ﺳ ﻮ ﻳ ﻪ LBA4404 منتقل و سپس ﺑ ﻪ ﮔ ﻴ ﺎ ﻩ گوجه فرنگی انتقال داده شد. ریز نمونه های برگ لپه ای ﺍ ﺯ ﮔ ﻴ ﺎ ﻩ گوجه فرنگی ﺑ ﺮ ﺍ ﻱ ﺗ ﺮ ﺍ ﺭ ﻳ ﺰ ﺵ مورد استفاده ﻗ ﺮ ﺍ ﺭ ﮔ ﺮ ﻓ ﺘ ﻨ ﺪ . ﮔ ﻴ ﺎ ﻫ ﺎ ﻥ ﺗ ﺮ ﺍ ﺭ ﻳ ﺨ ﺘ ﻪ احتمالی ﺑ ﺮ ﺭ ﻭ ﻱ ﻣ ﺤ ﻴ ﻂ MS ﻫ ﻤ ﺮ ﺍ ﻩ ﺑ ا ﻭ ﻳ ﺘ ﺎ ﻣ ﻴ ﻦ B5 ﺣ ﺎ ﻭ ﻱ 3/0 میلی گرم در لیتر NAA و 5/1 میلی گرم ﺩ ﺭ ﻟ ﻴ ﺘ ﺮ BAP و نیز 50 میلی گرم ﺩ ﺭ ﻟ ﻴ ﺘ ﺮ ﺁ ﻧ ﺘ ﻲ ﺑ ﻴ ﻮ ﺗ ﻴ ﻚ ﻛ ﺎ ﻧ ﺎ ﻣ ﺎ ﻳ ﺴ ﻴ ﻦ ﺍ ﻧ ﺘ ﺨ ﺎ ﺏ ﺷ ﺪ ﻧ ﺪ . ﺗ ﺠ ﺰ ﻳ ﻪ ﻣ ﻮ ﻟ ﻜ ﻮ ﻟ ﻲ ﮔ ﻴ ﺎ ﻫ ﺎ ﻥ ﺗ ﺮ ﺍ ﺭ ﻳ ﺨ ﺘ ﻪ (T0) ﺑ ﺎ ﺍ ﺳ ﺘ ﻔ ﺎ ﺩ ﻩ ﺍ ﺯ PCR ﻭ ﺟ ﻮ د ژن cry1a105 ﺭ ﺍ ﺩ ﺭ ﮔ ﻴ ﺎ ﻫ ﺎ ﻥ ﺗ ﺮ ﺍ ﺭ ﻳ ﺨ ﺘ ﻪ تائید ﻛ ﺮ ﺩ . از گیاهانی که PCR مثبت نشان دادند بذرگیری به عمل آمد، گیاهان مورد نظر تا نسل T2 کشت شدند و در این نسل وجود ژن انتقال یافته در آن ها با آنالیز مولکولی (RT-PCR) مورد بررسی قرار گرفت. گیاهانی که وجود ژن موردنظر در آن ها تائید شده بود با آزمون زیستی مورد بررسی قرار گرفتند. آزمون زیست سنجی مقاومت رقم گوجه فرنگی کارون را (70%) به آفت لارو هلیوتیس در مقایسه با شاهد نشان داد.

قارچ بیمارگر Rhizoctonia solani یکی از بیمارگرهای خاک زاد مهم است که دارای دامنه میزبانی وسیعی بوده و باعث مرگ گیاهچه یا پوسیدگی طوقه و ریشه در گیاهان میزبان می شود. استفاده از چند عامل کنترل در مدیریت تلفیقی آفات و بیماریها به عنوان یکی از روش های کارآمد در کنترل عوامل بیمارگر توصیه شده است که اهمیت آن به خصوص در بحث مدیریت مقاومت به سموم متداول بسیار زیاد است. در این بررسی، مقادیر EC50 و EC25 سه قارچ کش زینب، کاپتان و کربوکسین تیرام و دو عامل بیوکنترلی Pseudomonas fluorescens 73 و Trichoderma harzianum T22 در شرایط آزمایشگاهی و گلخانه ای علیه بیمارگر Rhizoctonia solani در بیماری مرگ گیاهچه پنبه مورد بررسی قرار گرفت. در بین قارچ کش های مورد بررسی، کربوکسین تیرام با EC50 معادل ppm 05/0 در مقایسه با زینب و کاپتان در کنترل بیمارگر موثرتر بود. در اختلاط قارچ کش های شیمیایی با آنتاگونیست T. harzianum T22 بیشترین میزان بازدارندگی مربوط به ترکیب مقادیر EC50آنتاگونیست با قارچ کش کربوکسین تیرام بود (75%). همچنین در اختلاط قارچ کش ها با باکتری آنتاگونیست P. fluorescens 73 نیز بیشترین بازدارندگی مربوط به ترکیب تیماری مقادیرEC50 و EC25 باکتری آنتاگونیست با قارچ کش کاپتان به دست آمد (هر دو 75%). در مطالعات گلخانه ای که تاثیر عوامل کنترلی به صورت انفرادی و در ترکیب با یکدیگر مورد بررسی قرار گرفته بودند، بیشترین کنترل در شاهد مثبت و EC50 قارچ کش ها در ترکیب با T. harzianum T22 و P. fluorescens 73 مشاهده شد. در این بررسی مشخص شد که تلفیق روش های کنترل در مدیریت این بیماری، نتیجه قابل قبولی در شرایط آزمایشگاهی دارد و در گلخانه نیز با این روش مدیریت تلفیقی، امکان کنترل بیماری پوسیدگی رایزوکتونیایی ریشه پنبه افزایش می یابد.

بیماری سوختگی فوزاریومی سنبله (FHB) گندم و جو با عامل قارچی Fusarium graminearum، به دلیل آلودگی به زهرابه-های قارچی گوناگون، آسیب قابل توجهی به عملکرد محصول گندم و کیفیت آن وارد می کند و تهدیدی جدی برای تندرستی انسان و جانوران به شمار می رود. از این رو، ارزیابی و بررسی سازوکار مولکولی مقاومت به بیماری در ارقام گوناگون گندم می-تواند از اهمیت ویژه ای در دستیابی به روش های کنترل غیرشیمیایی این بیماری برخوردار باشد. در این پژوهش، برای بررسی تأثیر بیماری FHB بر الگوی پروتئوم خوشه، شش رقم گندم نان و دوروم در گلخانه با جدایه F. graminearum تلقیح و علاوه بر اندازه گیری تغییرات صفات مورفولوژیک، 14 روز پس از تلقیح، تغییرات الگوی پروتئوم آن ها بررسی شد. جهت بررسی پاسخ بافت سنبله گندم به فوزاریوم، از تکنیک الکتروفورز دو بعدی استفاده شد. استخراج پروتئین به روش TCA-استون انجام و الکتروفورز دو بعدی در بعد اول به روش ژل های نواری و در بعد دوم با استفاده از ژل پلی اکریل آمید دودسیل سولفات انجام شد. نتایج حاصل از بررسی ژل ها نشان داد که از میان 57 لکه پروتئینی دارای تکرارپذیری، تعداد 13 لکه پروتئینی دارای تفاوت معنی دار در بین تیمارها بودند که از میان آن ها 11 لکه پروتئینی، افزایش بیان و دو لکه پروتئینی کاهش بیان نشان دادند. پروتئین های دارای تغییرات بیان بر اساس عملکرد زیستی در گروه های مختلفی دسته بندی شدند که پروتئین های دخیل در مسیرهای متابولیکی و درگیر در مقابله با بیماری (پروتئین Hypothetical و PR پروتئین ها) بیشترین سهم را در میان پروتئین های دارای تغییرات معنی دار به خود اختصاص دادند. نتایج این پژوهش می تواند در برنامه های به نژادی گندم استفاده شود.

یکی از مهمترین تنش های غیرزیستی، تنش شوری است که می-تواند به میزان زیادی عملکرد گیاهان زراعی را کاهش دهد. برای ارزیابی تنش شوری در ذرت هیبرید SC704از طریق رهیافت پروتئومیکس، آزمایشی به صورت فاکتوریل در قالب طرح کاملا تصادفی در سیستم کشت هیدروپونیک با سه تکرار اجرا شد. تنش شوری (صفر و 200 میلی مولار کلرید سدیم)، باعث کاهش صفت وزن خشک بخش هوایی نسبت به سایر صفات مورفولوژیک شد. به منظور بررسی پروتئین های دخیل در تنش شوری در مرحله رویشی، الگوی الکتروفورز دوبعدی پروتئوم برگ هیبرید SC704 مورد بررسی قرار گرفت. جهت استخراج پروتئین بافت برگ از روشTCA-استون استفاده شد. ژل های بعد دوم بعد از تصویر برداری، به کمک نرم افزارPD-quest، مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت و کمیت و کیفیت و فراوانی پروتئین ها در تیمارهای مختلف مورد مقایسه قرار گرفت. مقایسه الگوی پروتئوم برگ تحت تنش شوری، تغییر فراوانی 16 لکه پروتئینی را نشان داد. این لکه ها با پنج گروه عملکردی که شامل سوخت و ساز و تولید انرژی، ترجمه و پردازش، دفاعی و چرخه نیتروژن و سایر پروتئین های مرتبط هستند. پروتئینEGG APPARATUS-1 بیش ترین افزایش فراوانی را داشت که این افزایش بر اساس فاکتور القاء به دست آمد. این پروتئین در حفظ باروری گیاه تحت تنش در مرحله زایشی و تولید محصول نقش مهمی ایفا می کند. از میان پروتئین هایی که درگیر در دفاع سلول بودند، پروتئینV-type proton ATPase subunit F کاهش فراوانی نشان داد که این کاهش فراوانی منجر به مصرف کمتر ATP شده و به حفظ رشد ذرت تحت تنش شوری کمک می کند.

ویروس لکه برگی کلروتیک سیب (Apple chlorotic leaf spot virus, ACLSV) یکی از ویروس های مهم درختان میوه دانه دار و هسته دار می-باشد که گسترش جهانی دارد. هدف از این مطالعه، ساخت سازه بیانی و سپس بیان ژن پروتئین پوششی (Coat Protein (CP)) ویروس لکه-برگی کلروتیک سیب در باکتری Escherichia coli می باشد. بیان پروتئین پوششی در سیستم پروکاریوتی، نیاز به خالص سازی ویروس از گیاه میزبان را که مستلزم وجود اولتراسانتریفوژ است، مرتفع می سازد. به منظور تولید پروتئین پوششی نوترکیب، جدایه SSa از میزبان سیب جداسازی و با آغازگرهای اختصاصیACLSV-MF وACLSV-MR ژن کامل پروتئین پوششی به طول 582 جفت باز تکثیر شد. ژن کامل CP به حامل همسانه سازی pTG19 متصل و به باکتری E. coli سویه DH5α منتقل شد. باکتری های تراریخت شده با پلاسمید نوترکیب روی محیط کشت LB حاوی آمپی سیلین، X-Gal و IPTG غربال و به روش تجزیه قلیایی استخراج گردیدند. این ژن در پلاسمید استخراج شده با آنزیم های BamHI و XhoIکه محل اثر آنها در آغازگرها قرار داده شده بودند، برش و به حامل بیان pET28a(+) که با همین دو آنزیم برش داده شده بودند، اتصال داده شد. pET28a (+) حاوی ژن CP ویروس در باکتری E. coli سویه BL21(DE3) ترانسفورم و سپس القاء بیان CP با اضافه نمودن IPTG در غلظت نهایی 1mM پس از چهار ساعت در الکتروفورز در ژل پلی اکریل آمید حاوی سدیم دودسیل سولفات (SDS-PAGE) بررسی شد. نتایج حاصل از SDS-PAGE حاکی از بیان پروتئین حدود 26 کیلودالتونی مربوط به ژن پروتئین پوششی ویروس مذکور بود. بیان این پروتئین می تواند برای تولید آنتی بادی بر علیه ACLSV مورد استفاده قرار گیرد.

کشت ریشه های مویین روش موثری برای تولید متابولیت های ثانویه ی گیاهی می باشد زیرا ریشه های مویین از پایداری ژنتیکی و بیولوژیکی برخوردارند و قادر به تولید متابولیت ها در زمان کوتاه و بدون نیاز به هورمون می باشند. کاسنی با نام علمی Cichorium intybus L. از جمله گیاهان دارویی ارزشمند بوده و شامل ترکیبات دارویی مهمی می باشد. در این تحقیق، القای ریشه های مویین توسط Agrobacterium rhizogenesسویه ی ATCC11325 انجام شد. در آزمایش اول تاثیر نوع و سن ریزنمونه و مدت هم کشتی بر کارایی القای ریشه های مویین بررسی شد. در آزمایش دوم تاثیرلاین های مختلف ریشه های مویین بر میزان رشد ریشه ها بررسی شد. در آزمایش سوم تاثیر غلظت های مختلف نفتالین استیک اسید (5/1 و 1، 5/0، 0 میلی گرم در لیتر) و ساکارز (6 و 5، 4، 3 درصد) بر میزان تجمع زیست توده بررسی شد. نتایج بدست آمده نشان داد که بیشترین درصد القای ریشه های مویین (55/75 درصد) و تعداد ریشه (26/7 ریشه در هر ریزنمونه) مربوط به ریزنمونه های کوتیلدون 5 روزه است. همچنین معلوم شد که 5/1 میلی گرم در لیتر NAA در ترکیب با 3 و 4 درصد ساکارز بیشترین تأثیر را در افزایش وزن تر، خشک و شاخص رشد داشت. بیشترین محتوای فنول کل و همچنین فلاونوئید در طول موج 270 نانومتر، در ریشه های مویین رشد کرده در محیط کشت حاوی 5/1 میلی گرم در لیتر NAA در ترکیب با 4 درصد ساکارز مشاهده شد در حالی که بیشترین میزان فلاونوئید در طول موج 300 و 330 نانومتر، در ریشه های مویین رشد کرده در محیط کشت حاوی 5/1 میلی گرم در لیتر NAA در ترکیب با 5 درصد ساکارز به دست آمد.

اصلاح ساختار ریشه می تواند با بهبود رشد، استقرار در خاک، جذب آب و مواد مغذی و بیوسنتز اسیدهای آمینه و هورمون ها به افزایش عملکرد دانه و کیفیت مطلوب بذر منجر شود. ساختار ریشه با جذب مواد مغذی، مقاومت به ورس و تحمل به خشکی، مرتبط است. با در نظر گرفتن بحران کم آبی در کشور، تولید گیاهان متحمل در برابر خشکی اهمیت دارد. در این پژوهش برای ایجاد گیاه برنج متحمل به خشکی، سه ژن تغییردهنده ساختار ریشه برنج که در افزایش طول، تعداد، قطر و زاویه رشد ریشه نقش دارند پس از ساخت یک سازه سه ژنی برای انتقال به گیاه برنج رقم هاشمی استفاده شدند. ژن های OsEXPA8، OsNAC5 و DRO1 برگرفته از ارقام وحشی برنج طی مراحلی تحت پیشبر مختص ریشه و پیشبر دائمی بر اساس ماهیت ژن کاندید همسانه سازی و در ناحیه T-DNA ناقل دوگانه اگروباکتریومی قرار داده شدند. سازه حاصل موسوم به pUhrN5ExDro به آگروباکتریوم سویه EHA105 منتقل و برای انتقال ژن به جنین های نارس برنج رقم هاشمی مورد استفاده قرار گرفت. پس از انجام مراحل انتقال ژن، گیاهان باززا شده حاصل از جنین های نارس که در محیط انتخابی حاوی 50 میلی گرم بر لیتر هیگرومایسین در مراحل مختلف کالوس زایی، باززایی و ریشه زایی زنده مانده و رشد کرده بودند به محلول یوشیدا و سپس به گلدان منتقل شدند. گیاهان تراریخته حاصل توسط واکنش زنجیره ای پلیمراز مختص سازه و مختص ژن مورد تایید قرار گرفتند. محل الحاق تراژن با واکنش زنجیره ای پلیمراز معکوس در کروموزوم 10 برنج تعیین شد. مقایسه فنوتیپ ریشه با گیاه شاهد تفاوت ظاهری در ساختار ریشه نشان داد. سازه چند ژنی حاصل را می توان با هدف تغییر ساختار ریشه به منظور تحمل به خشکی برای انتقال ژن به سایر گیاهان نیز مورد استفاده قرار داد. امید است تولید برنج تراریخته با تغییر ساختار ریشه بتواند تحمل به خشکی را در این محصول مهم زراعی افزایش و سبب کاهش مصرف آب در کشت برنج شود.

بیماری "جاروک" که توسط عامل"Candidatus phytoplasma aurantifolia" به وجود می آید یکی از بیماری های مهم مرکبات در ایران، غرب آسیا و شمال آفریقا می باشد که سبب ایجاد خسارت اقتصادی زیادی شده است. در این پژوهش اثر تنش بیماری جاروک بر پروتئوم برگ گیاه لیموی رقم مکزیکن مورد بررسی قرار گرفت. نمونه های برگی از گیاهان جمع آوری شده و با الکتروفورز دوبعدی (2-DE) و سپس طیف سنجی جرمی (MS) مطالعه شدند. توان بالای (2-DE) در تفکیک پروتئین ها این امکان را فراهم می سازد که انواع تغییر کیفی (بودن یا نبودن و یا تغییر مکان) و کمی (افزایش یا کاهش بیان) پروتئین در شرایط تنش و نرمال مطالعه شوند. از میان هشتصد و یک پروتئین برگی که با استفاده از نرم افزار ملانی Melani6)) در هشت تکرار زیستی سالم و هشت تکرار زیستی آلوده مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند، شصت وسه پروتئین نسبت به بیماری پاسخ نشان دادند که از این تعداد نوزده پروتئین توسط طیف سنج جرمی شناسایی شدند، این پروتئین ها در مقابله با تنش اکسیداتیو، فتوسنتز، متابولیسم و پاسخ به تنش شرکت داشتند که با شناسائی این پروتئین ها می توان مسیرهای پاسخ جدیدتر و ژن هائی که آن ها را کنترل می کنند آشکارکرد و همچنین نتایج این پژوهش می تواند در به نژادی لیموی مکزین لایم مورد استفاده قرار گیرد.

از مهمترین اهداف اصلاح برنج به دست آوردن ارقام جدید با عملکرد بالا، کیفیت بهتر و مقاوم در برابر تنش های زیستی و غیرزیستی به کمک مهندسی ژنتیک است. در این آزمایش، اثر غلظت های مختلف تنظیم کننده های رشد گیاهی (Kin، 2, 4-D، NAA) و پرولین (200، 400 و600 میلی گرم در لیتر) در کالوس زایی چند رقم زراعی (شامل موسی طارم، نعمت، دم سرخ، غریب، علی کاظمی و درفک) و همچنین اثر سویه های آگروباکتریوم تومه فاشینز LBA4404)، EHA105، AGL-1) و غلظت باکتری (1 و 6/0، 2/0 OD600=) در تراریزش رقم برگزیده مورد مطالعه قرار گرفت و نتایج حاصل در قالب آزمایشات فاکتوریل بر پایه طرح کاملا تصادفی، تجزیه و تحلیل شد. نتایج نشان داد که بین تنظیم کننده های رشد و ژنوتیپ در پاسخ به کالوس زایی اختلاف معنی داری وجود داشت. بیشتر ارقام در بیشتر ترکیبات هورمونی درصد کالوس زایی بالای 80% را داشتند. دربین ارقام مورد مطالعه، رقم حسن سرایی بیشترین میزان رشد کالوس (49/0 گرم) را در محیط کشت حاوی 2 mg/l 2, 4-D داشت و ارقام غریب و دم سرخ نیز بیشترین وزن کالوس (بالای4/0 گرم) را در محیط دارای 2 mg/l 2, 4-D و 2 mg/l NAA تولید کردند. استفاده از اسیدآمینه پرولین میزان رشد کالوس ها را در مقایسه با شاهد کاهش داد و با افزایش میزان پرولین، رشد کالوس کاهش بیشتری داشت. کمترین میزان وزن کالوس های برنج (138/0 گرم) در محیط کشت دارای mg/l 600 پرولین مشاهده شد. در میان سه سویه بکار گرفته شده در تراریزش برنج، کالوس های تراریخته تنها با استفاده از سویهEHA105 بدست آمدند. هر چند اختلاف معنی داری را بین غلظت های مختلف آگروباکتریوم در تراریزش برنج مشاهده نشد، ولی باکتری در غلظت 1 OD600= کالوس های تراریخته بیشتری را تولید کرد. باتوجه به نتایج به دست آمده رقم دم سرخ قابلیت کالوس زایی بیشتری را در محیط دارای 2, 4-D داشته و می توان از آن در انتقال ژن با اهداف مختلف استفاده نمود.

لاکتوگلوبولین (BLG) یکی از بزرگترین آلرژن های شیر گاو است که باعث هضم کم شیر می شود. وجود دو پیوند دی سولفیدی هضم این پروتئین را کاهش داده است. به نظر می رسد استفاده از احیا کننده هایی که بتوانند باندهای دی سولفیدی موجود در این پروتئین را احیاء کنند، هضم پذیری این پروتئین را افزایش می دهند. بدین منظور در این مطالعه از سیستم گلوتاتیون/ تیوردوکسین گیاهی برای افزایش هضم پذیریBLG استفاده شد. تیوردوکسین ها (Trxs)، دی سولفیدردوکتازهای هستند که در تنظیم اکسیداسیون/ احیاء سلولی دخالت دارند که خود توسط گلوتاتیون (GSH) احیاء می شوند. در این مطالعه با در دست داشتن باکتری تراریخته مقدار قابل توجهی از این پروتئین ها تولید و خالص سازی شد. برای احیاء BLG از سیستم نوترکیب تیوردوکسین/ گلوتاتیون گیاه برنج به نام سیستم GSH/OsTrx20 استفاده شد. بدین منظور BLG ابتدا با اجزای این سیستم همراه با GSH در دماهای مختلف 4، 25 و37 درجه سانتیگراد پیش تیمار شد. سپس BLG با تریپسین مورد هضم آنزیمی قرار گرفت. میزان هضم پذیری BLG با استفاده از ژل SDS-PAGE و RP-HPLC بررسی شد. نتایج نشان داد که پیش تیمار BLG با استفاده از سیستم GSH/OsTrx20 به طور قابل توجهی بر هضم پذیری آن با آنزیم تریپسین مؤثر بوده است.