پژوهش های آسیب شناسی زیستی
سال:1388 | دوره:12 | شماره:3 |تعداد مقالات:10

هدف: بررسی تاثیر اجزای پروتئینی و اسید نوکلئیکی توکسوپلاسما گوندی بر بلوغ سلول های دندریتیک و توانایی آن ها در تولید IL-12 و تکثیر لنفوسیت های T اختصاصی آنتی ژن های توموری.مواد و روش ها: سلول های مغز استخوان موش به مدت پنج روز در حضور GM-CSF و IL-4 کشت داده شدند. روز پنجم سلول های دندریتیک نابالغ به دست آمده با لیزات تومور و اجزای پروتئینی و اسید نوکلئیکی توکسوپلاسما گوندی و لیپوپلی ساکارید به مدت دو روز کشت داده شدند. برای بررسی عملکرد سلول های دندریتیک در تحریک لنفوسیت های T از آزمون MLR استفاده شد. از کیت الایزا برای اندازه گیری میزان IL-12 استفاده و بلوغ سلول های دندریتیک با فلوسیتومتری بررسی شد.نتایج: سلول های دندریتیک بالغ شده با اجزای پروتئینی توکسوپلاسما باعث تکثیر معنی داری در سلول های طحالی در مقایسه با دیگر گروه ها شد و میزان تولید IL-12 در این گروه بالاتر بود (p<0.001).نتیجه گیری: ترکیبات مختلف پیکره میکروبی مانند اجزای پروتئینی و اسید نوکلئیکی توکسوپلاسما گوندی می توانند باعث افزایش قابلیت عرضه آنتی ژن سلول های دندریتیک به لنفوسیت ها شوند که در این میان تاثیر اجزای پروتئینی از اجزای اسید نوکلئیکی بیشتر بوده است.

هدف: تب راجعه کنه ای بیماری حاد عفونی است که توسط اسپیروکتی به نام بورلیا پرسیکا ایجاد و توسط کنه های نرم اورنیتودوروس تولوزانی منتقل می شود. این بیماری در خاورمیانه و نیز مناطق زیادی از کشور ایران دیده می شود. یکی از مشکلات موجود درباره این بیماری تعیین آلودگی در کنه ها برای تعیین ناقل بیماری است که به روش کلاسیک گزنودیاگنوزیز انجام می شود که عبارت است از خون دهی کنه ها روی حیوان حساس آزمایشگاهی و بررسی میکروسکوپی خون حیوان پس از 7-14 روز، که روشی ناکارآمد و طولانی مدت است. در این مطالعه کارایی دو روش مولکولی PCR و کلاسیک گزنودیاگنوزیز برای تعیین آلودگی کنه های اورنیتودوروس تولوزانی به بورلیا پرسیکا مقایسه شده است.مواد و روش ها: نمونه های کنه از مناطق شمال غرب کشور جمع آوری و روی خوکچه هندی آلوده به بورلیا خونخواری نمودند. برای آزمایش های کلاسیک پس از هضم کامل خون، این کنه ها مجددا روی خوکچه های سالم خونخواری نموده و پس از 5 تا 14 روز، آلودگی خون آن ها به بورلیا با بررسی های میکروسکوپی مشخص شد. برای PCR،DNA  بورلیا همراه با DNA کنه ها استخراج و به کمک آغازگرهای اختصاصی ژن 16S-rDNA، ژنوم بورلیا تکثیر و سپس تعیین توالی شد. در این مطالعه همچنین تاثیر جنس کنه (ماده و نر)، گذشت زمان و حداقل آلودگی لازم برای عملکرد PCR ارزیابی شد.نتایج: بررسی های مولکولی به کمک آغازگرهای اختصاصی ژن 16S-rDNA نشان داد که روش PCR می تواند آلودگی را در تمامی کنه های آلوده مشخص نماید در حالی که روش کلاسیک قادر به تشخیص آلودگی در (13.3 درصد) نمونه های آلوده بود. جنس کنه (ماده و نر) و گذشت زمان پس از خونخواری (بلافاصله تا هضم کامل خون) تاثیری بر نتایج واکنش PCR نداشت. ضمن این که وجود یک بورلیا کافی بود تا نتیجه واکنش PCR مثبت شود.نتیجه گیری: این مطالعه اولین ارزیابی تشخیص مولکولی عامل تب راجعه بومی به روش PCR در ایران است و به لحاظ سرعت، دقت و کارایی بالا می تواند جایگزین روش کلاسیک شود و برای تشخیص آلودگی در ایران و سایر مناطق آلوده در خاورمیانه توصیه شود.

هدف: این مطالعه به منظور بررسی امکان تشخیص نشانگان داون پیش از تولد با روش Real-Time PCR انجام شد. در این راستا، تعیین روش مناسب برای تخلیص DNA از نمونه های آمنیوسیت برای دستیابی به DNA با کیفیت بالا نیز مورد توجه قرار گرفت.مواد و روش ها: ابتدا زنان بارداری که در غربالگری از طریق سنجش نشانگرهای بیوشیمیایی و سونوگرافی خطر بالای ابتلای جنین به نشانگان داون را داشتند، به مرکز ﺁمنیوسنتز معرفی شده و از مایع آمنیوتیک آن ها نمونه گیری شد. تخلیص DNA از 59 نمونه مایع آمنیوتیک با روش های مختلف انجام شد که این روش ها شامل روش جوشاندن، روش رسوب دهی با نمک، دستورالعمل استخراج DNA از خون و بافت با کیت DNPTM (سیناژن)، دستورالعمل استخراج DNA از سلول با کیت DNA Isolation Kit for cells and tissues (Roche)، دستورالعمل استخراجDNA  از بافت با کیت (Roche) MagNa Pure DNA Isolation  و کیت (Qiagen) QIAamp DNA Micro بودند. سپس کیفیت و کمیت نمونه های تخلیص شده به وسیله دستگاه اسپکتروفتومتر نانودراپ NanoDrop® ND-1000 ارزیابی شد. واکنش Real-Time PCR با استفاده از رنگ سایبرگرین (Applied Biosystems, UK) I به منظور تکثیر اختصاصی ژن های DYRK1A2 و DSCAM و ژن مرجع PMP22 روی نمونه های تخلیص شده انجام شد. آنالیز داده ها با استفاده از روش مقایسه ای چرخه آستانه برای تعیین میزان ژنی و تعیین تعداد نسخه های کروموزوم 21 صورت گرفت.نتایج: این بررسی نشان داد که DNA استخراج شده از نمونه های مایع آمنیوتیک با استفاده از کیت QIAamp DNA Micro  دارای کمیت و کیفیت مطلوب است. تکثیر اختصاصی ژن های هدف و مرجع انجام و تفاوت گروه طبیعی و گروه مبتلا بر اساس اختلاف در چرخه آستانه مشخص شد.نتیجه گیری: تشخیص پیش از تولد با روش Real-Time PCR روی نمونه های DNA تخلیص شده از سلول های مایع آمنیوتیک با استفاده از کیت Qiagen امکان پذیر است. نتایج حاصل با نتایج مشابه حاصل از روش های متداول سیتوژنتیک قابل مقایسه است.

هدف: روش تداخل RNA یا RNAi بهترین روش خاموش کردن ژن ها در سطح ترانس کریپتومی شناخته شده است، سرطان ها و بیماری های ژنتیکی اهداف مهمی برای توسعه روش های درمانی مبتنی بر RNAi به شمار می روند. برای حل مشکل خاموشی موقتی سیستم های siRNA، RNA های سنجاق سری یا shRNAها ابداع شدند و نسل جدید shRNAها به نام shRNAmir است. سازه خاموش گر با ساختار سنجاق سری شبه(shRNAmir) microRNA ، رفتاری مشابه یک microRNA طبیعی را درون سلول تقلید می کند. کمک فعال کننده گیرنده استروئیدی(SRA)  یکی از تنظیم کننده های گیرنده استروئیدی از جمله گیرنده استروژنی (ER) است. بافت های پروستات، رحم و سینه بیان پایینی از  SRA  دارند، در حالی که طی تومورزایی آن ها بیان SRA افزایش می یابد، بنابراین امکان شرکت SRA در تومورزایی یا پیشروی توموری وجود دارد.مواد و روش ها: در مطالعه حاضر از روش RNA تداخل گر یا RNAi برای خاموش نمودن ژن SRA استفاده شد و سازه خاموش گر SRA طراحی و توسط  Soe-PCR ساخته شد و سپس در پلاسمید pEGFPC1 که یک ناقل بیانی است کلون گردید. رده سلولی انسانی سرطان پستان (MCF7) با پلاسمید حاصل ترانسفکت شد و بیان SRA در زمان های 24، 72 ساعت و 10 روز بعد با Real-Time PCR بررسی شد.نتایج: کاهش 60 درصدی در بیان نسبی SRA در تیمارهای 72 ساعت و 10 روز بعد مشاهده شد که نشان می دهد shRNAmir-SRA با موفقیت توانسته است بیان ژن هدف مطالعه حاضر را به طور نسبتا پایداری خاموش کند.نتیجه گیری: با توجه به موفقیت در طراحی و ساخت یک سازه shRNAmir و خاموشی نسبتا پایدار ژن هدف، این سازه برای مطالعات مختلفی در آینده آماده و مناسب به نظر می رسد.

هدف: با توجه به آثار مرگ بار آفلاتوکسین ها و به خصوص آفلاتوکسین B1 بر سلامتی انسان، اندازه گیری آفلاتوکسین متصل به آلبومین، به عنوان یک شاخص مهم میزان در معرض بودن به آفلاتوکسین ضروری به نظر می رسد. هدف از این پژوهش، بهینه سازی روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا و آشکارگر فلورسانس به منظور اندازه گیری این شاخص در خون است.مواد وروش ها: در این مطالعه، از نمونه سرم خون سه گروه رت به عنوان کنترل  مثبت (تیمار شده با آفلاتوکسین B1)، کنترل (بدون تیمار خاص) و استاندارد (تیمار شده با میزان معینی آفلاتوکسین B1 نشان دار با تریتیوم) استفاده شد. پس از جداسازی آلبومین از نمونه سرم با استفاده از آمونیوم سولفات و اسیداستیک، خلوص آلبومین با الکتروفورز SDS-PAGE بررسی و غلظت آن به روش برادفورد اندازه گیری شد. سپس آلبومین تحت تاثیر پروناز هیدرولیز شد تا آفلاتوکسین متصل به آلبومین به صورت آفلاتوکسین - لیزین آزاد شود. سپس آنزیم پروناز و باقیمانده حاصل از هیدرولیز آلبومین توسط استون در سرما رسوب داده و جدا شد. حجم محلول رویی را با دستگاه فریز - درایر تقلیل داده و سپس نمونه تغلیظ شده به دستگاه HPLC تزریق و مقدار آفلاتوکسین موجود در آن در مقایسه با نمونه مشابه حاصل از رت های گروه استاندارد، اندازه گیری شد.نتایج: با الکتروفورز SDS-PAGE، خلوص آلبومین جدا شده اثبات شد و غلظت آن در نمونه های کنترل مثبت، منفی و استاندارد به ترتیب 10، 12.5 و 13 میلی گرم در میلی لیتر به دست آمد. در روش HPLC حداقل میزان تشخیص (Detection limit) برای اندازه گیری آفلاتوکسین متصل به آلبومین، 20 پیکوگرم در هر میلی گرم آلبومین، اختصاصیت روش، 92 درصد و حساسیت آن، 100 درصد تعیین شد. میانگین میزان آفلاتوکسین متصل به آلبومین در سرم رت های کنترل مثبت، 10 نانوگرم در هر میلی گرم آلبومین محاسبه شد و تکرارپذیری روش طی بارها تکرار، بسیار خوب ارزیابی شد.نتیجه گیری: در این تحقیق برای اندازه گیری آفلاتوکسین متصل به آلبومین به روش HPLC تغییراتی در فاز متحرک، درصد حلال ها و زمان هر آزمایش ایجاد شد و همچنین کروماتوگرافی میل ترکیبی قبل از انجام HPLC حذف شد. بر این اساس HPLC-Fluorescence به عنوان یک روش دقیق، حساس و اختصاصی و با بهینه سازی ایجاد شده با سرعت و سهولت بیشتر، تکرارپذیری بالاتر و هزینه کمتر می تواند برای اندازه گیری آفلاتوکسین B1 در سرم استفاده شود.

هدف: مهندسی بافت، علمی میان رشته ای است که اساس آن مبتنی بر به کارگیری داربست های پلیمری برای شکل گیری سه بعدی بافت است. از این داربست ها به عنوان ماتریکس خارج سلولی سنتتیک برای چسیندگی سلول ها، تکثیر و تمایز سلولی استفاده می شود. مواد زیستی مورد استفاده در مهندسی بافت می بایست از ترکیب شیمیایی، ساختار فیزیکی و عملکرد زیستی مناسب برخوردار باشند. در پروژه حاضر، ترکیب کیتوزان / پلی وینیل الکل به عنوان داربست برای ترمیم بافت عصبی انتخاب شده است.مواد و روش ها: برای تولید داربست های کیتوزان / پلی وینیل الکل با استحکام مکانیکی و ریخت شناسی مناسب در کاشت و تکثیر سلول های عصبی U373 از روش الکتروریسی استفاده شد. روش الکتروریسی نسبتا ساده بوده و می توان به وسیله آن الیافی به فرم لایه نازک بی بافت تولید کرد. پس از آن میزان زیست سازگاری داربست با استفاده از آزمون های زیستی و ارزیابی میزان چسبندگی سلولی مورد بررسی قرار گرفت.نتایج: نتایج کسب شده نمایان گر آن هستند که نانوکامپوزیت کیتوزان / پلی وینیل الکل با نسبت 15.85 ضمن تامین ریخت شناسی و استحکام مکانیکی لازم، امکان رشد سلول های عصبی U373 به فضای درونی ماده زیستی و جایگزینی آن ها را در طول زمان و به صورت کنترل شده فراهم می کند. بدین ترتیب شرایط لازم برای رشد و توسعه سلولی و همچنین جدا شدن از بافت رشد یافته فراهم می شود.نتیجه گیری: با استفاده از نانوکامپوزیت کیتوزان / پلی وینیل الکل به دلیل زیست سازگاری مناسب و عدم سمیت، امکان رشد سلول های U373  و اتصال مناسب آن ها به نانوکامپوزیت برای ترمیم آسیب وارده به اعصاب محیطی فراهم می شود.

هدف: استافیلوکوکوس اورئوس از عوامل مهم عفونت های شدید در بیمارستان و جامعه است. سویه های مقاوم به متی سیلین این باکتری شیوع و مرگ و میر بالا دارند. بنابراین برای درمان آنتی بیوتیکی و کنترل پخش عفونت لازم است که سویه های مقاوم به متی سیلین به سرعت و دقت شناسایی شوند. در این تحقیق مقاومت به متی سیلین با روش انتشار دیسک، آگار دایلوشن و PCR برای ژن mecA بررسی شد.مواد و روش ها: 174 سویه استافیلوکوکوس اورئوس از نمونه های مختلف بالینی از سه بیمارستان آموزشی جدا شد. حساسیت آنتی بیوتیکی با روش انتشار دیسک تعیین شد و حداقل غلظت مهارکنندگی اگزاسیلین با آگار دایلوشن و PCR برای ژن mecA با آغازگرهای اختصاصی انجام شد.نتایج: فراوانی سویه های مقاوم به متی سیلین با روش انتشار دیسک، آگار دایلوشن و PCR به ترتیب 50 درصد، 47.7 درصد و 48.2 درصد مشاهده شد و سویه های mec مثبت نسبت به آنتی بیوتیک های آزمایش شده بسیار مقاوم تر از سویه های mec منفی بودند. نتایج آگار دایلوشن، مقاومت سطح پایین به متی سیلین (حداقل غلظت مهارکنندگی کمتر از 64 میلی گرم در لیتر) را نشان داد. پراکندگی سویه های مقاوم به متی سیلین در سه بیمارستان مورد بررسی مشابه بود و اختلاف معنی دار بین حضور سویه های مقاوم به متی سیلین در نمونه های مختلف بالینی مشاهده نشد.نتیجه گیری: PCR بهترین روش برای شناسایی روتین سویه های مقاوم به متی سیلین است به طوری که می تواند 24 ساعت قبل از سایر روش های معمول سویه های مقاوم به متی سیلین را شناسایی کند.

هدف: در تحقیق حاضر اثر بازدارندگی از رشد پلی فنل های برگ سبز چای به عنوان مواد ضدقارچی گیاهی بر مخمر فرصت طلب کاندیدا آلبیکنس (سویه استاندارد PTCC-5027) در دو زمان 24 و 48 ساعت بررسی شد.مواد و روش ها: با استفاده از آزمون حساسیت دارویی با روش ماکرودیلوشن براث (رقت در لوله)، حداقل غلظت کشندگی ضدقارچی (MFC) و کمترین غلظت مهارکنندگی از 90 درصد رشد قارچ (MIC90) برای پلی فنل های برگ سبز چای و فلوکونازول علیه کاندیدا آلبیکنس  (PTCC-5027) در دو زمان 24 و 48 ساعت بررسی شد.نتایج: فعالیت ضدقارچی کاتشین (موثرترین ترکیب برگ سبز چای) وابسته به زمان است. کمترین غلظت مهارکنندگی کاتشین در مقادیر 0.5×103، 1×103 و 2×103 مخمر در میلی لیتر پس از 24 ساعت به ترتیب 12.5، 25 و 100 میلی لیتر در میلی گرم و پس از 48 ساعت به ترتیب 6.25، 12.5 و 50 میلی لیتر در میلی گرم به دست آمد. مخمر نسبت به فلوکونازول مقاوم گزارش شد. کلیه نتایج با محاسبات میانگین آماری، پس از 3 بار تکرار ثبت شد.نتیجه گیری: با وجود مقاومت استرین کاندیدا آلبیکنس مورد مطالعه نسبت به فلوکونازول، پلی فنل های برگ سبز چای خصوصا کاتشین، به خوبی از رشد این مخمر ممانعت کرده و کاهش رشد در غلظت های MIC90 و MFC مشهود است. بر اساس نتایج به دست آمده، برگ سبز چای حاوی ترکیبات موثر ضدقارچی بوده و از آن جایی که داروهای ضدقارچی رایج، دارای آثار سوء جانبی هستند و از طرفی نیز شاهد افزایش مقاومت های دارویی هستیم، امید است با ساخت داروهای گیاهی از مواد موثر آن ها، جایگزین خوبی برای درمان بیماری های قارچی تجویز شود.