یکی از چالش های موجود در تفسیر نتایج qPCR، اطمینان از اختصاصی بودن قطعات تکثیر شده است که برای بررسی آن از آنالیز منحنی ذوب استفاده می شود. پیک های اضافی در منحنی ذوب همیشه نشان دهنده یک مشکل نیست، به همین منظور در این مقاله یک ابزار مبتنی بر وب به نام uMelt SM به عنوان راهکاری کاربردی و ساده برای آنالیز صحیح منحنی ذوب به محققین پیشنهاد می گردد که امکان پیش بینی منحنی ذوب DNA و پروفیل های واسرشته سازی را با وضوح بالای فلورسنت از محصولات PCR فراهم می کند. نتایج این مطالعه نشان داد که منحنی های ذوب براساس چه پارامترهایی تولید شده و الگوریتم مناسب برای نحوه کار با این نرم افزار ارائه گردید. در نهایت ژن های اکتین و سوپراکسید دیسموتاز از قارچ Pyricularia oryzae به عنوان الگوی مناسب برای تعیین منحنی پیش بینی شده با استفاده از این نرم افزار ارائه گردید و منحنی Real-time PCR نیز ترسیم شد. براساس نتایج منحنی ذوب با استفاده از نرم افزار uMelt SM در مقایسه با منحنی ذوب دستگاه Real-Time PCR تطابق بالایی را نشان می دهد که این نتایج تأییدی بر مزیت هایی همچون سهولت استفاده، صرفه جویی در زمان، هزینه و تلاش در بخش تجربی با استفاده از این نرم افزار می باشد.

بیماری نیوکاسل یکی از مخرب ترین بیماری های ویروسی طیور در سرتاسر جهان است. باتوجه به اینکه روش های سنتی قابلیت محدودی در کنترل این بیماری دارند، هدف از انجام این مطالعه استفاده از تکنولوژی های نوین برای تشخیص به موقع بیماری جهت کاهش خسارت پیش روی صنعت طیور می باشد. در این مطالعه به منظور تشخیص ویروس نیوکاسل، یک روش Real-time-PCR بهینه سازی گردید. استخراج RNA با استفاده از کیت RNease mini (شرکت کیاژن، آمریکا) و بر اساس دستورالعمل شرکت سازنده استخراج شد.RNA استخراج شده با 68.23×109 رونوشت اولیه به صورت سری رقت های 100ml برای انجام واکنش Real-time PCR تهیه شد. در این آزمایش از سویه B1 واکسن ویروس استفاده شد. آزمایش Real-time-PCR با استفاده از کیت تجاری ساخت شرکت Genekam Biotechnology کشور آلمان انجام شد. حساسیت واکنش Real-time PCR با توجه به سری رقت های تهیه شده 34-10×1 رونوشت/میکرولیتر تعیین گردید. با توجه به اینکه سرعت و دقت تشخیص ویروس نیوکاسل در همه گیری ها، نقش مهمی در کنترل بیماری دارد. استفاده از این روش به عنوان یک روش تشخیصی با حساسیت بالا توصیه می گردد.

روش Real-time PCR در سال های اخیر به عنوان روشی انتخابی جهت تشخیص بسیاری از بیماری های عفونی در آزمایشگاه ها مورد استفاده قرار گرفته است. با استفاده از این فن آوری، واکنش زنجیره پلیمراز توسط مولکول های گزارش گر فلورسنت انجام و از این طریق، تولید فرآورده های تکثیری طی هر چرخه واکنش PCR گزارش می شود. بدین ترتیب مجموعه ای از خصوصیات از جمله، حساسیت و اختصاصیت بالا، داده های قابل اعتماد و خطر پایین آلودگی، فن آوری Real-time PCR را به جایگزینی مناسب برای PCR معمولی تبدیل کرده است. این روش اغلب در تعیین کمیت سطوح بیان ژن نیز مورد استفاده قرار می گیرد. از آنجایی که تمامی مراحل Real-time PCR در داخل یک لوله دربسته انجام می شود، خطر ایجاد آلودگی در آن در مقایسه با PCR معمولی بسیار کاهش یافته و در نتیجه از حصول نتایج مثبت کاذب جلوگیری می شود. هدف از این مقاله، مرور کلی در مورد انواع مختلف روش Real-time PCR، مزایا و کاربردهای آن می باشد.

طی سال های 1388-1389 از روش real time RT-PCR و RT-PCR معمولی جهت شناسایی ویروس زبان آبی در 310 گوسفند مشکوک به بیماری زبان آبی استفاده شد. قطعاتS1  (ژن پلی مراز) و S10 (ژن NS3) بعنوان ژنهای حراست شده در گروه سرمی زبان آبی به ترتیب توسط  rRT-PCR و RT-PCR معمولی مورد آزمایش قرار گرفتند و در نهایت تعداد 58 (%18.6) و 14 (%4.5) نمونه مثبت شناسایی شدند. جهت ارزیابی حساسیت rRT-PCR نسبت به RT-PCR معمولی از رقت های لگاریتمی RNA ویروس زبان آبی (BTV16) استفاده شد. نتایج حاکی از آن بود که با روش RT-PCR عیار بیش 103.8 TCID50/ml قابل شناسایی است، در حالیکه در روش rRT-PCR مرز تشخیص در حد101.8 TCID50/ml  از RNA ویروس در نمونه های بالینی می باشد. در این مطالعه مشخص شد روش rRT-PCR از حساسیت فوق العاده ایی برخوردار است. دام هائی که در انتهای بیماری هستند و عیار ویروسی در خون آنها بسیار کاهش یافته است با این روش قابل شناسایی می باشند. در این مطالعه سعی شد از برخی از نمونه های مثبت که باروش rRT-PCR شناسایی شدند، جداسازی ویروس صورت گیرد. برای این منظور از روش تزریق به عروق کوریوآلانتوئید تخم مرغ جنین دار و کشت سلول Vero و KC استفاده شد. علیرغم تلاش های صورت گرفته جداسازی ویروس امکان پذیر نشد.

هدف: بز کرکی راینی یکی از مهمترین نژادهای بز در ایران است. این حیوانات هم برای تولید گوشت و هم برای تولید کرک نگهداری می شوند. یکی از اقدامات اساسی در حیوانات اهلی مطالعه ژن ها و پروتئین های مرتبط با صفات اقتصادی و مطالعه آنها در سطح سلولی یا کروموزومی است. یکی از ژن های مهم لپتین است. لپتین به وسیله بافت چربی سفید تولید می شود و نقش مهمی در تنظیم مصرف غذا، تعادل انرژی، باروری و فعالیت های ایمنی بازی می کند. هدف این پژوهش مطالعه بیان ژن لپتین در بافت های چربی، کبد، کلیه، شش و قلب در بز کرکی راینی با استفاده از تکنیک Real Time PCR بود. مواد و روش ها: از بافت های قلب، شش، کلیه، کبد و بافت چربی (از هر بافت 3 تکرار) از 6 بز کرکی راینی نمونه برداری انجام شد. از این بافت ها RNA کل استخراج شد. RNA استخراج شده در دمای منفی80 درجه سانتیگراد نگهداری شد. کیفیت و کمیت RNA بررسی و سنتز cDNAانجام شد. واکنش Real Time PCR برای ژن لپتین و بتااکتین صورت گرفت. محصولات PCR روی ژل آگارز 5/1 درصد الکتروفورز شد. منحنی های ذوب و سطوح مختلف بیان در بافت های ذکر شده، مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. نتایج: نتایج منحنی های Real Time PCR و مشاهده نتایج الکتروفورز محصولات PCR روی ژل آگارز نشان داد نشان داد که این ژن در تمامی بافت های بررسی شده بیان شده است و بیشترین سطح بیان در بافت چربی (5/4 برابر) و کبد (7/3 برابر) و کمترین سطح بیان در بافت های قلب (4/1 برابر) مشاهده شد. نتیجه گیری: این نتایج می تواند نشان دهنده این امر باشد که لپتین در متابولیسم چربی نقش ویژه ای دارد. مطالعات بیشتری باید انجام شود تا نقش لپتین در فیزیولوژی ساخت و متابولیسم چربی و مواد دیگر مشخص شود. این امر کمک خواهد کرد تا مکانیسم هایی برای شناخت اثر فاکتورهای تغذیه ای و چربی های بدن در فرآیندهای مختلف درک شوند.

در این تحقیق از روش مولکولی  Real Time PCRبرای اندازه گیری کپک رایزوپوس اوریزا در رب گوجه فرنگی استفاده شد. به دلیل مشکلات روش شمارش کپک ها به روش شماره نسبی کپک ها از قبیل احتمال خطای آزمون کننده، دقت کم و عدم تکرارپذیری، تبیین یک روش استاندارد که بتواند با دقت و تکرارپذیری بالا تشخیص و شمارش کپک ها را امکان پذیر سازد ضروری به نظر می رسد. روش مولکولی  Real Time PCRمی تواند به عنوان یک روش مناسب برای شناسایی و اندازه گیری کمی دقیق کپک ها مطرح باشد که بر مبنای اندازه گیری مطلق و نسبی ژن های کپک های موجود می باشد. نمونه های رب گوجه فرنگی با مقادیر مختلف اسپور کپک (101، 103 و 105) در هر گرم آلوده شد. پس از گرمخانه گذاری و رشد اسپور کپک و ایجاد میسیلیوم استخراج  DNAاز هر نمونه با استفاده از روش السامرایی انجام شد. سپس با استفاده از واکنش PCR تعداد کپی DNA کپک با استفاده از شناساگر سایبر گرین و پرایمرهای مربوط به جنس رایزوپوس اوریزا تعیین شد. نتایج نشان داد که با افزایش مقدار  DNAکپک در نمونه های شاهد و تلقیح شده منحنی  Real Time PCRدر مقادیر CT کمتری به فاز لگاریتمی وارد می شوند. ضریب همبستگی خطی منحنی استاندارد در آزمون PCR Real Time (R2=0.943) بود که نشان دهنده یدقت تعیین کمی این آزمون می باشد. اختصاصی بودن واکنش با استفاده از منحنی ذوب پرایمرها تعیین شد و نشان داد که واکنش به طور کاملا اختصاصی انجام شده است.