پژوهش های سلولی و مولکولی
سال:1396 | دوره:30 | شماره:3 |تعداد مقالات:10

عفونت های ناشی از باکتری های مقاوم چنددارویی یک مشکل در حال افزایش می باشد. علت آن ظهور و انتشار مقاومت دارویی میکروبی و عدم توسعه آنتی بیوتیک های جدید است. استفاده از محصولات فیتوشیمیایی و عصاره گیاهان به عنوان عوامل کاهنده مقاومت به طور فزاینده ای، به یک موضوع تحقیق فعال تبدیل شده است. هدف این پژوهش مطالعه اثر عصاره حاوی کل آلکالوئیدهای استخراج شده از دانه گیاه تلخ بیان بر میزان حداقل غلظت مهاری و تجمع درون سلولی سیپروفلوکساسین در موتانت مقاوم باکتری اشریشیا کلی بود. برای این منظور از روش رقت های متوالی برای تعیین مقادیر حداقل غلظت مهاری و از سنجش های اسپکتروفلوریمتری برای اندازه گیری میزان تجمع درون سلولی آنتی بیوتیک سیپروفلوکساسین استفاده شد. نتایج نشان داد که عصاره مورد استفاده باعث کاهش حداقل غلظت مهاری سیپروفلوکساسین شد. همچنین این عصاره باعث افزایش تجمع آنتی بیوتیک در موتانت مقاوم باکتری اشریشیا کلی گردید. در نتیجه، عصاره حاوی آلکالوئیدهای دانه گیاه تلخ بیان می تواند از طریق تاثیر بر پمپ انتشار به خارج AcrAB-TolC غشاء باعث افزایش حساسیت به سیپروفلوکساسین در موتانت های مقاوم شود.

حلال های بسازودگداز (DES) در واکنش های آنزیمی، از اهمیت بسزایی برخوردار می باشند. این حلال ها تماس موثر بین واکنشگر و آنزیم را میسر می سازد و از اینرو می تواند موجب افزایش پایداری و فعالیت آنزیم شود. بیولومینسانس پدیده تولید و نشر نور توسط موجودات زنده است. واکنش شیمیایی اصلی در بیولومینسانس شامل رنگدانه مولد نور لوسیفرین، و آنزیم لوسیفراز می باشد.آنزیم لوسیفراز اکسیداسیون لوسیفرین را کاتالیز می کند که به مولکول حامل انرژی آدنوزین تری فسفات نیاز دارد. لوسیفراز به دلیل محصولی که به سهولت قابل ردیابی است، کاربردهای فراوانی در بیوتکنولوژی و زیست شناسی مولکولی یافته است. با این حال، پایداری حرارتی پایین، عدد تبدیل کم و تمایل شدید لوسیفراز به ATP موجب محدودیت در استفاده از سیستم های مبتنی بر لوسیفراز در کاربردهای تجاری شده است. استفاده از حلال های بسازودگداز روشی نوین جهت پایدارسازی پروتئین ها و کاتالیزورهای زیستی است. یک گروه از حلال های بسازودگداز عموما شامل یک نمک ارگانیک و گروه های دهنده هیدروژن می باشند که در نتیحه آن پیوندهای هیدروژنی تشکیل می شوند. در این مطالعه، اثرات این حلال ها بر ویژگی های سینتیکی آنزیم لوسیفراز Lampyris turkestanicus وحشی و جهش یافته (E354R/Arg356) در حضور کولین کلراید: گلیسرول با نسبت مولی 1:2 به عنوان حلال بسازودگداز بررسی شد. بدین منظور، هر دو آنزیم وحشی و جهش یافته در باکتری اشریشیاکلی سویه BL21 بیان گردید و پروتئین مورد نظر از طریق کروماتوگرافی تمایلی تخلیص و برای مطالعات سینتیکی استفاده شد. بر اساس نتایج به دست آمده، حلال بسازودگداز باعث افزایش پایداری دمایی لوسیفرازهای وحشی و جهش یافته E354R/Arg356 شد.

در تحقیق حاضر برای تعیین جدایه های مناسب استرپتومایسس، اثرات آنتاگونیستی 30 جدایه استخراج شده از خاکهای استان کرمان علیه قارچ بیمارگر Sclerotinia sclerotiorum مورد بررسی قرار گرفت. از مجموع این جدایه ها، 10 جدایه استرپتومایسس در روش Dual Culture از خود خاصیت آنتاگونیستی نشان دادند که بیشترین آن به استرپتومایسس جدایه UK 363 مربوط بوده است. آنگاه به منظور بررسی رابطه فیلوژنی و تنوع ژنتیکی 30 جدایه مذکور، استخراج DNA از آنها به روش CTAB صورت گرفت و از 10 آغازگر RAPD جهت انجام PCR استفاده شد. پس از انجام الکتروفورز 128 باند قوی و واضح در محدوده 250bp تا 2800 bp تشخیص داده شد. اطلاعات بدست آمده توسط نرم افزار NTSYS و به روش UPGMA با ضریب تشابه دایس آنالیز شدند. درختچه بدست آمده، 30 جدایه استرپتومایسس را در خط برش 58%، در دو گروه کلی قرار داد. در گروه اول 10 جدایه دارای خاصیت آنتاگونیستی و در گروه دوم 20 جدایه فاقد خاصیت قرار گرفتند. گروه بندی جدایه ها با استفاده از روش تجزیه به مولفه های اصلی نیز انجام شد و پلات های دو بعدی و سه بعدی مربوطه رسم گردید و جدایه ها به هشت گروه مختلف تقسیم شدند.

تشکیل ریشه های مویین بوسیله انتقال ژن های خاصی از پلاسمید باکتری آگروباکتریوم رایزوژنز به ریزنمونه های گیاهی صورت می گیرد. استفاده از این ریشه ها سبب افزایش تولید متابولیت های ثانویه با ارزش دارویی می شود. یکی از مهمترین عواملی که باعث عدم تولید ریشه های مویین در ریزنمونه های گیاهی پس از مجاورت با سویه های مختلف باکتری آگروباکتریوم رایزوژنز می شود، قهوه ای شدن ریزنمونه ها است. علت قهوه ای شدن ریزنمونه های برگی احتمالا آزاد شدن ترکیبات فنولی از محل های زخم ریزنمونه ها و یا به منظور اجرای مکانیسم های دفاعی توسط سلول های گیاهی به منظور مقابله با آلودگی بوسیله باکتری آگروباکتریوم رایزوژنز می باشد. در پژوهش حاضر، میزان قهوه ای شدن ریزنمونه های برگی چهار گونه گیاهی از خانواده سولاناسه شامل (آتروپا بلادونا، هیوسیاموس نایجر، داتورا استرامونیوم و داتورا متل) پس از آلودگی با سویه های مختلف آگروباکتریوم رایزوژنز (AR318، AR15834، AR9543، A7، AR9402، A4) مورد بررسی قرار گرفتند. نتایج این پژوهش نشان داد که در هر چهار گونه گیاهی، کمترین میزان قهوه ای شدن (2 و 6 درصد) در ریزنمونه های برگی آلوده شده با سویه های A4 و AR15834 مشاهده گردید. بنابراین، استفاده از این دو سویه برای القای ریشه های مویین در گونه های مربوط به خانواده سولاناسه مناسب تر است.

گیاهان منابع پتانسیلی از آنتی اکسیدان های طبیعی هستند و ترکیبات آنتی اکسیداتیو گوناگونی برای خنثی کردن گونه های اکسیژن واکنش پذیر تولید می کنند. هدف از این مطالعه اندازه گیری میزان فنول و فلاونوئید تام و فعالیت آنتی اکسیدانی 4 نوع عصاره مختلف پوست تنه و شاخه درخت بید همدان بود. دراین این مطالعه تجربی، برای اندازه گیری ترکیبات آنتی اکسیدانی آزمون فنول و فلاونوئید کل به کار رفت. جهت ارزیابی خاصیت آنتی رادیکالی از آزمون دی فنیل پیکریل هیدرازیل (DPPH) استفاده گردید. داده های بدست آمده با استفاده از نرم افزار SPSSV:16 تجزیه و تحلیل شدند. بیشترین محتوای فنول کل مربوط به عصاره اتانولی پوست شاخه های جوان و پوست تنه به ترتیب به میزان 69.98±1.41 و 60.87±1.19 میلی گرم اسید گالیک بر گرم وزن خشک و کمترین میزان فنول هم مربوط به عصاره های کلروفرمی بود. بیشترین محتوای فلاونوئید کل در پوست شاخه و تنه، مربوط به عصاره اتانولی به میزان 71.20±4.08 و 60.87±1.19 و نیز کمترین مقادیر مربوط به عصاره های کلروفرمی پوست تنه و شاخه به میزان 12.56±0.29 و 13.80±0.57 بدست آمدند. همچنین بیشترین فعالیت مهار رادیکال های آزاد DPPH بعد از اسید آسکوربیک مربوط به عصاره اتانولی شاخه و تنه به ترتیب 0.129 و 0.130 بودند. بین میانگین های فلاونوئید کل و فنول کل عصاره پوست تنه و شاخه اختلاف معنی داری وجود داشت. در نتیجه، بهترین فعالیت های آنتی اکسیدانی مربوط به عصاره اتانولی شاخه و تنه بودند.

آنزیم چاویکول -O- متیل ترانسفراز یک آنزیم کلیدی در مسیر ساخته شدن فنیل پروپانوئیدها در ریحان (.Ocimum basilicum L) یک گیاه دارویی و معطر از خانواده نعناعیان (Lamiaceae) است. در این پژوهش اثر الیسیتور کیتوزان بر میزان اسانس، ترکیبات فنیل پروپانوئیدی و بیان ژن آنزیم چاویکول -O- متیل ترانسفراز در گیاه ریحان تحت شرایط تنش خشکی مورد بررسی قرار گرفت. تیمارهای این تحقیق شامل تنش خشکی (نرمال، تنش ملایم و متوسط) و محلول پاشی کیتوزان با غلظت های 0.2 و 0.4 گرم در لیتر بودند. میزان متیل چاویکول به وسیله کروماتوگرافی گازی (GC) و کروماتوگرافی گازی متصل به طیف سنج جرمی (GC/MS) تعیین شد و سطح بیان ژن چاویکول -O- متیل ترانسفراز نیز با روش Semi-quantitative RT-PCR بررسی گردید. نتایج تجزیه واریانس نشان داد میزان اسانس، میزان بیان ژن چاویکول -O- متیل ترانسفراز و ترکیب متیل چاویکول تحت تاثیر تنش خشکی و الیسیتور کیتوزان در مقایسه با نمونه های شاهد افزایش معنی داری یافت، به طوری که بیشترین میزان آن با به کارگیری غلظت 0.4 گرم در لیتر از کیتوزان در تنش ملایم یعنی آبیاری در 30 تخلیه رطوبتی از ظرفیت زراعی به دست آمد. تغییرات میزان ترکیب متیل چاویکول با میزان بیان ژن آنزیم چاویکول -O- متیل ترانسفراز مطابقت داشت، که می توان بخشی از این تغییرات را ناشی از تغییر در سطح بیان ژن آنزیم چاویکول -O- متیل ترانسفراز درنظرگرفت. بنابراین کیتوزان به عنوان یک الیسیتور زیستی می تواند از طریق افزایش بیان ژن و فعالیت آنزیم چاویکول -O- متیل ترانسفراز سبب افزایش ترکیبات فنیل پروپانوئیدی گیاه ریحان در شرایط تنش خشکی شود.

هندوانه ابوجهل از گیاهان دارویی ضد سرطان است که ساپونین ها و فلاونوئیدهای موجود در آن، سیستم ایمنی بدن را تحریک کرده و از این رو یکی از مهمترین گیاهان داروئی می باشد. باززایی مستقیم گیاهچه در جمعیت های ایرانی این گیاه در جهت تکثیر درون شیشه ای آن بسیار کاربردی خواهد بود. به این منظور، آزمایشی بصورت فاکتوریل در قالب طرح کاملا تصادفی انجام شد که فاکتورهای آن شامل ریزنمونه (ساقه و برگ)، ترکیبات هورمونی (سطوح مختلف BAP و NAA)، محیط کشت (MS کامل، ½ MS و MS ¼) و جمعیت (گچساران و دهدشت) بودند. نتایج نشان دادند که در جمعیت دهدشت، ریزنمونه ساقه بهتر از ریزنمونه برگ، ولی در جمعیت گچساران میزان باززایی مستقیم از هر دو ریزنمونه یکسان بود. با توجه به صفات درصد شاخساره زایی، تعداد شاخساره و طول شاخساره در هر دو جمعیت دهدشت و گچساران، ترکیب هورمونی 1.5 میلی گرم در لیتر BAP همراه با 1 میلی گرم در لیتر NAA در محیط کشت ½ MS بهترین باززایی مستقیم را در هر دو جمعیت (به ترتیب 44.4 و 33.3 درصد) نشان داد. بهترین محیط ریشه زایی برای گیاهچه های حاصل از باززایی در هر دو جمعیت گچساران و دهدشت محیط کشت MS حاوی 0.5 میلی گرم در لیتر NAA و 0.5 میلی گرم در لیتر BAP بود (به ترتیب 76.8 و 73.33 درصد). نتایج این تحقیق نشان داد که دو جمعیت ایرانی مورد بررسی به کشت بافت و باززای مستقیم گیاهچه پاسخ خوبی می دهند.

قارچ اندوفیت Piriformospora indica جذب مواد غذایی را در گیاهان افزایش داده و اجازه بقای گیاه تحت تنش های زیستی و غیر زیستی را می دهد. این قارچ همچنین رشد و تولید بذر را تحریک می کند و سبب افزایش متابولیت های ثانویه گیاهان دارویی می شود. مطالعات کمی در رابطه با کشت قارچ های همزیست وجود دارد لذا توسعه روش هایی که قادر به کشت انبوه قارچ های همزیست باشد، می تواند برای مطالعات عملی مناسب باشد. هدف این تحقیق تهیه محیط کشت ساده با بازده بالاتر جهت تولید زیست توده بیشتر برای این قارچ است. مقایسه دو محیط کشت ساده YPG (عصاره مخمر، پپتون، گلوگز) و پیچیده کافر بر اساس میزان وزن خشک قارچ صورت گرفت، سپس برای طراحی آزمایشات جهت بهینه سازی محیط از روش تاگوچی در بررسی تاثیر چهار عامل غلظت گلوکز، غلظت عصاره مخمر، غلظت پپتون و pH محیط بر روی غلظت زیست توده قارچ مورد نظر در یک کشت غیر مداوم استفاده شد. مقایسه منحنی رشد در دو محیط کافر و YPG نشان داد که قارچ P. indica در محیط YPG رشد بهتر و بیشتری دارد. پس از بهینه سازی محیط YPG میزان تولید زیست توده به 19.3 گرم در لیتر در مقایسه با میزان اولیه یعنی 16.2 گرم در لیتر رسید. با توجه به تولید 2.5 برابری وزن خشک قارچ P.indica و همچنین ساخت مقرون به صرفه محیط کشت YPG نسبت به محیط کافر، می توان از محیط YPG به عنوان محیط کشت مناسب برای تولید انبوه این قارچ در کشاورزی استفاده نمود.

به منظور بهینه کردن شرایط انتقال ژن به گیاه دارویی زنیان عوامل مختلف شامل رقت آگروباکتریوم، سویه آگروباکتریوم، نوع آنتی بیوتیک کشنده آگروباکتریوم، غلظت استوسرینگون و مدت زمان تلقیح بر روی تعداد گیاهان باززا شده با استفاده ازسازه ژنی p6U-Ubi-FVT دارای ژن انتخابی HPT و ژن fld بررسی شد. غلظت 20 میلی گرم در لیتر هیگرومایسین برای غربالگری سلول های تراریخت و جلوگیری از تولید کالوس در سلول های غیر تراریخت بهترین غلظت تشخیص داده شد. اثر متقابل سه عامل تراکم سلولی آگروباکتریوم، سویه آگروباکتریوم و نوع آنتی بیوتیک کشنده آگروباکتریوم بر تعداد گیاهان باززا شده در سطح احتمال یک درصد معنی دار بود و رقت 0.8-0.6 آگروباکتریوم ´ سویه GV3101 آگروباکتریوم ´ غلظت 160 میلی گرم در لیتر آنتی بیوتیک کشنده تیمنتین اثر بازدارنده کمتری بر تعداد گیاهان باززا شده داشتند. بیشترین تعداد گیاهان باززا شده مقاوم به آنتی بیوتیک هیگرومایسین مربوط به غلظت 254.8 میکرومولار در لیتر استوسرینگون بود. گیاهان باززا شده بیشتری در مدت زمان تلقیح 30 دقیقه نسبت به زمان های تلقیح 20 دقیقه و 1 دقیقه حاصل شد همچنین تفاوت آماری معنی داری بین میانگین تعداد گیاهان باززا شده حاصل از 20 دقیقه و 30 دقیقه زمان تلقیح مشاهده نشد. بررسی حضور ژن مورد نظر با استفاده از واکنش زنجیره ای پلی مراز روی گیاهان باززا شده انجام شد. نتایج وجود حداقل یک نسخه از ژن هدف را در ژنوم گیاهان تائید کرد. برتری گیاهان تراریخت نسبت به گیاهان غیرتراریخت در تحمل به تنش اسمزی -0.3 مگاپاسکال توسط آزمون زیست سنجی تحمل به تنش اسمزی تایید گردید.

اگرچه تیره آلاله (Ranunculaceae) به دلیل داشتم ویژگی های تکاملی جالب موضوع مطالعات مختلف بوده است، اما مطالعات تکوینی در برخی از سرده های آن به طور محدود صورت گرفته و برخی از سرده های آن تاکنون مطالعه نشده اند. در این پژوهش مراحل و چگونگی تکوین پرچم و تخمک در گیاه آلاله آبی Batrachium fluitans بررسی شد. گلها و غنچه ها در مراحل مختلف نموی برداشت، در فیکساتور FAA70 تثبیت و در الکل 70 درصد نگهداری شد. نمونه ها پس از آب گیری و قالب گیری در پارافین با میکروتوم برش گیری و رنگ آمیزی با هماتوکسیلین و ائوزین انجام گرفت. لام های تهیه شده از مراحل مختلف تکوینی با دقت با استفاده از میکروسکوپ نوری بررسی، و از مراحل تکوینی مورد نظر عکس تهیه شد. .بر اساس نتایج حاصل از این بررسی، در گونه مورد مطالعه تخمک از نوع واژگون است. سلول مگاسپور موقعیت لایه سوم تا چهارم زیر اپیدرمی دارد، تقسیم میوز منجر به تولید تترادهای خطی و یا T شکل می شود. موقعیت مگاسپور عملکردی از نوع بنی است، تکوین کیسه رویانی از تیپ پلی گونوم تبعیت می کند و لقاح سلول تخم ضمیمه بر تخم اصلی مقدم است. نتایج نشان داد تکوین پرچم ها با پدید آمدن توده های سلولی بیضی شکلی بر روی نهنج آغاز می شود و تعداد پرچم ها پنج عدد است که خامه را در بر گرفته اند. لایه های بساک از بیرون به داخل شامل یک لایه سلول اپیدرمی، یک لایه مکانیکی، یک لایه میانی (موقت) و یک لایه تاپی در مجاورت سلول های مادر گرده می باشد. سلول های لایه تاپی در مراحل مختلف نمو بساک و دانه های گرده در جای خود ثابت باقی مانده و تحلیل نمی روند و این لایه از نوع ترشحی است. تترادهای میکروسپوری از نوع تترهدرال هستند. میکروسپورها در زمان آزاد شدن واکوئله نبوده، دارای شکل منظم، سیتوپلاسم متراکم و هسته مشخص در وسط هستند. دانه های گرده بالغ از نوع دو سلولی هستند.