پژوهش های سلولی و مولکولی
سال:1392 | دوره:26 | شماره:2 |تعداد مقالات:8

GR- RBP2 یکی از 8 عضو خانواده GR-RBP در گیاه آرابیدوپسیس است که پس از ترجمه درمیتوکندری جای می گیرد. مطالعه حاضر به منظور بررسی پروتئومیکی گیاهان تراریخت شده با GR-RBP2 در مقایسه با گیاه وحشی صورت گرفته است. در این مطالعه ژن GR-RBP2 از گیاه آرابیدوپسیس جداسازی و در پلاسمید pBIN19 کلون شد. سپس پلاسمید نوترکیب از طریق باکتری Agrobacterium tumefaciens و به روش Floral Dipping به گیاه آرابیدوپسیس انتقال یافت. با انتقال cDNA کامل GR-RBP2 بیست و یک لاین به دست آمد. گیاهان تراریخت شده از نظر فنوتیپی و زمان گلدهی تفاوتی را با گیاه وحشی نشان نداده و قادر به تولید بذر بودند. میزان بیان ژن در سه لاین تراریخت شده مختلف و گیاه وحشی تعیین شد.میزان mRNA درگیاهان تراریخت شده 2 برابر بیشتر از گیاه وحشی بود. آنالیز پروتئومیکی با استفاده از دو سیستم ژل مختلف صورت گرفت: 22D IEF/SDS PAGE و 2D Blue-native/SDS PAGE. تمام ژلها با نقره رنگ آمیزی شدند. نتایج حاصل از ژل الکتروفورز 2 بعدی نشان داد که پروتئین GR-RBP2 در لاینهای تراریخت شده افزایش بیان داشته است. این نتایج نشان داد که پروتئینهای زنجیره تنفسی در لاینهای تراریخت شده مورد بررسی و گیاه وحشی به فراوانی وجود دارد. کمپلکس V زنجیره تنفسی (کمپلکس (F1 تا حدودی تخریب شده بود اما این امردر تمام لاینهای تراریخت شده و گیاه وحشی مشابه بود. آنالیز طیفهای MS به شناسایی 110 لکه پروتئینی منجر شد که 6 لکه پروتئینی در لاینهای تراریخت شده در مقایسه با گیاه وحشی افزایش نشان داد. نگاهی به برخی پروتئینهای شناخته شده نشان داد که هیچ تغییرعمده ای که نشاندهنده تحریک یا سرکوب برخی مسیرهای متابولیکی باشد وجود ندارد.

جنس Crocus شامل تقریبا هشتاد گونه است که عمدتا توسط گونه زراعی آن Crocus sativus شناخته می شود. تنوع ژنتیکی میان 16 نژادگان جنس فوق در ایران برای اولین بار توسط نشانگر ISSR مورد مطالعه قرار گرفت. چهارده نشانگر، در مجموع  208قطعه قابل تشخیص و تکرار پذیر تولید کردند که تمام قطعات چند شکل بودند. قطعات ایجاد شده بر اساس وجود و عدم وجود امتیاز دهی شدند و از داده های فوق برای محاسبه ضرایب شباهت دایس، جاکارد و تطابق ساده استفاده گردید. دندروگرام مربوطه توسط نرم افزار NTSYSpc (نسخه 2.02) و بر اساس الگوریتم Complete Linkage و UPGMA ترسیم گردید. تجزیه و تحلیل خوشه ای، نژادگان را به پنج گروه اصلی تقسیم نمود. علاوه بر این، نمودارهای به دست آمده از تحلیل PCoA نیز نژادگان را به پنج گروه تفکیک می نماید. قدرت تفکیک تجمعی برابر با 134، میزان کمینه قدرت تفکیک برابر با 4.87 در آغازگر UBC872 و میزان بیشینه برابر با 15.5 در آغازگر UBC851 و متوسط قدرت تفکیک برابر با 9.6 می باشد. نتایج به دست آمده سودمندی بالای نشانگر های ISSR را برای گروه بندی گونه های Crocus و تحلیل روابط زنتیکی آنها را نشان می دهد.

لوسیفرازها آنزیمهایی هستند که از سوبسترایی به نام لوسیفرین همراه با ATP و Mg2+ و اکسیژن مولکولی برای انتشار نورهایی با رنگهای متنوع استفاده می نمایند. بسته به فاکتورهای متفاوت - که یکی از مهم ترین آنها اسیدآمینه های تشکیل دهنده لوسیفراز است - نورهایی با طیف رنگی متفاوت از لوسیفرازها منتشر می شود. لوسیفراز حشره شب تاب گونه ایرانی با نام علمی Lampyris turkestanicus نور سبز منتشر می کند. در این کار برای اولین بار کریستال لوسیفراز جهش یافته Lampyris turkestanicus (E354R/R356/H432Y) - که نور قرمز ساطع می کند- به منظور مطالعه و تعیین ساختار سه بعدی و در نهایت مطالعه مکانیسم تغییر رنگ در مقایسه با لوسیفرازهای تعیین ساختار شده دیگر با روش کریستالوگرافی اشعه X تهیه شد. تهیه کریستال با استفاده از روش کریستالوگرافی قطره نشسته انجام شد و کریستال تتراگونالی با حد تفکیک 2.2 آنگستروم به دست آمد. تک واحدهای کریستال دارای ابعاد a=85.01 b=85.01 c=97.09 است.

مواد پکتینی، پلی ساکارید های پیچیده غنی از زیر واحد های گالاکتوز می باشند. مطالعات نشان داده است که، این مواد قادر به القای آپوپتوز در سلولهای سرطانی هستند. تحقیق حاضر جهت بررسی اثر آپوپتوزی اسید پکتیک (AP) و پکتین مرکبات (CP) روی دودمان سلولی سرطان پروستات انسانی DU145، که وابسته به آندروژن می باشد، صورت گرفته است. با تغییر pH و دما نمونه های تغییر یافته ای از اسید پکتیک و پکتین مرکبات به دست آمد و اثر این مواد (MCP ((modified acid pectic) MAP و (modified citrus pectin) و نیز روی سلولهای مذکور مورد بررسی قرار گرفت. اثر آپوپتوتیکی این مواد پکتینی با Pectasol، به عنوان کنترل مثبت در القای آپوپتوز روی این سلولها، مقایسه گردید. درصد آپوپتوز سلولها پس از تیمارهای مختلف، به وسیله رنگ آمیزی آکریدین اورنج و اتیدیوم برماید و همچنین بررسی سیکل سلولی با استفاده از تکنیک فلوسایتومتری، مورد بررسی قرار گرفت.نتیجه این مطالعه نشان می دهد که، غلظت5 mg/ml  از محلولهای AP، MCP و 1 mg/ml از Pectasol میزان بالای آپوپتوز را در سلولهای سرطانی DU145 نسبت به کنترل القاء می کند (p<0.001). در حالی که MAP با همین دز قدرت آپوپتوتیکی کمی را نشان می دهد. در ضمن، درصد نکروز سلولها، توسط رنگ آمیزی آکریدین اورنج و اتیدیوم برماید، مطالعه گردید. میزان آپوپتوز سلولها نسبت به میزان نکروز آنها به مراتب بالاتر می باشد. نتیجه این پژوهش نشان داد که، CP قدرت القای آپوپتوز در سلولهای DU145 را ندارد و پس از آنکه به وسیله pH و دما تغییر پیدا می کند (MCP) دارای قدرت آپوپتوتیک می شود. در حالی که، AP یا پکتین سیب بدون تغییر دارای این قدرت است و اگر تغییر داده شود، یعنی به مولکولهای کوچکتر تبدیل گردد این قدرت را به طور معنی دار از دست می دهد. این مساله می تواند حاکی از برتری پکتین سیب به پکتین مرکبات باشد، پکتین سیب، مولکولی کوچکتر از پکتین مرکبات دارد و در بخش خوراکی این میوه قرار دارد و بدون نیاز به شکسته شدن توسط تغییرات دما و pH قادر به القای آپوپتوز در سلولهای سرطانی تحت تیمار خود می باشد، در حالی که پکتین مرکبات دارای مولکولی بزرگ است که به صورت طبیعی قادر به القای آپوپتوز در سلولهای سرطانی پروستات DU145 نمی باشد. در ضمن این پکتین در پوست غیر خوراکی آن بوده و نیاز به شکسته شدن توسط دما و pH، برای القای آپوپتوز در سلولهای سرطانی تحت تیمار خود دارد.

تک یاختگان مژه دار مانند Paramecium caudatum را می توان در محیط کشت مخمر پرورش داد. در این پژوهش تاثیر دما و غنی سازی محیط کشت مخمر بر رشد و تکثیر جمعیت P. caudatum بررسی شد. رشد جمعیت P. caudatum در محیط کشت مخمر تحت دماهای مختلف (40-20 درجه سانتی گراد) و تحت غنی سازی با یونهای Ca2+ و Mg2+ و اسید آمینه ال-آرژینین مورد مقایسه قرار گرفت. طبق نتایج، جمعیت این جانوران 48 ساعت پس از پاساژ در دمای 30 درجه سانتی گراد نسبت به سایر دماها افزایش قابل ملاحظه ای داشت (p<0.001). همچنین غنی کردن محیط کشت با یونهای Ca2+ و Mg2+ و به ویژه افزودن اسید آمینه ال-آرژینین در دمای بهینه موجب افزایش بیشتر جمعیت P. caudatum در این محیط نسبت به محیط کشت معمولی مخمر شد (p<0.001). بررسی منحنی رشد این جانوران تک سلولی در محیط کشت معمولی مخمر تحت دمای بهینه نشان داد که رشد و تکثیر این جانوران تک سلولی دارای چهار مرحله است. مقایسه منحنیهای رشد محیط معمولی نسبت به محیط غنی شده، نشان دهنده رشد بیشتر سلولها در محیط غنی شده نسبت به محیط معمولی است. بر اساس یافته های حاضر محیط کشت غنی شده مخمر را تحت دمای 30 درجه سانتی گراد می توان به عنوان یک محیط کشت مصنوعی مناسب برای تکثیر و ازدیاد P. caudatum معرفی کرد.

گل محمدی یکی از گونه های ارزشمند گیاهی است که در بسیاری از کشورها از جمله ایران سابقه کشت زیادی دارد. به منظور بررسی تنوع سیتوژنتیکی بین جمعیتهای مختلف گل محمدی موجود در موسسه تحقیقات جنگلها و مراتع کشور، تعداد 14 جمعیت (اکسشن) انتخاب شد و از قلمه ریشه دار شده آنها مریستم انتهایی ریشه تهیه گردید. برای مطالعات کاریوتیپی این جمعیتها از سیستم آنالیز تصویری و برای اندازه گیری پارامترهای سیتوژنتیکی از نرم افزار Micromeasure استفاده شد. داده ها پس از جمع آوری در قالب یک طرح کاملا تصادفی با 3 تکرار مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. نتایج نشان داد که بین جمعیتها از لحاظ پارامترهای سیتوژنتیکی طول بازوی کوتاه، طول بازوی بلند، نسبت بازوی بلند به بازوی کوتاه، شاخص عدم تقارن درون کروموزومی، درصد شکل کلی کاریوتیپ، درصد بازوی بلند و درصد بازوی کوتاه اختلاف معنی داری در سطح 1 درصد و برای صفت طول کل کروموزوم بین جمعیتها اختلاف معنی داری در سطح 5 درصد وجود داشت. در تجزیه به مولفه های اصلی، سه مولفه اول بیش از 98 درصد از کل واریانس بین جمعیتها را توجیه نمودند. در مولفه اول با سهم 51درصد از کل واریانس، صفات طول بازوی کوتاه، نسبت بازوی بلند به بازوی کوتاه، شاخص عدم تقارن درون کروموزومی و درصد شکل کلی به عنوان مهم ترین صفات در گروه بندی جمعیتها شناخته شدند. در مولفه دوم با سهم 24 درصد از کل واریانس، صفات درصد بازوی بلند و درصد بازوی کوتاه دارای اهمیت بیشتری در ایجاد تنوع بودند. همچنین در مولفه سوم با سهم 22 درصد از کل واریانس، صفات طول بازوی بلند و طول کل کروموزوم نقش بیشتری در ایجاد تنوع بین جمعیتها داشتند. برای گروه بندی جمعیتها بر اساس صفات کاریوتیپی، تجزیه خوشه ای به روش Ward انجام شد که با برش دندروگرام در فاصله اقلیدسی 4.35، جمعیتها در 4 کلاس مختلف قرار گرفتند. در این بررسی بیشترین فاصله بین دو جمعیت اصفهان 9) و ایلام 1) و کمترین فاصله بین دوجمعیت گیلان 1) و اصفهان 7) مشاهده شد. دیاگرام حاصل از پراکنش جمعیتها بر اساس سه مولفه اصلی، جمعیتهای مورد بررسی را در 4 گروه قرار می دهد که این امر موید نتایج حاصل از خوشه بندی است.

باکتری اشریشیا کلی انتروتوکسی‍‍ژنیک (ETEC) شایع ترین عامل اسهال باکتریایی کودکان زیر پنج سال و همچنین رایج ترین عامل اسهال مسافر در بالغین در دنیا است، که سالانه تعداد زیادی از کودکان را به کام مرگ کشانده و تعداد کثیر دیگری را تحت تاثیر قرار می دهد. از این رو هدف WHO تولید واکسن علیه این عامل می باشد. فیمبریه CFA/I یکی از عوامل ویرولانس مهم و شایع این باکتری است که نقش اساسی در فرآیند بیماریزایی این باکتری دارد. از این رو پروتئین انتهایی این فیمبریه (CFaE) می تواند به عنوان کاندید واکسن مطرح باشد.هدف از این مطالعه، بررسی امکان بیان پروتئین نوترکیب CFaE از توالی طبیعی ژن مربوطه بعد از همسانه سازی آن در ناقل بیانی، بوده است. بعد از طراحی پرایمر برای ژن cfaE، با استفاده از واکنش PCR تکثیر شد. در مرحله بعد، ژن مذکور در ناقل pTZ57R/T همسانه سازی اولیه و سپس با استفاده از آنزیمهای محدودالاثر در ناقل بیانی (+)pET28a  زیر همسانه سازی شد. بررسی بیان با استفاده از ماده IPTG با تغییر پارامترهای مختلف صورت گرفته در دو میزبان E. coli سویه های BL21(DE3)pLysS و Rosetta مورد ارزیابی قرار گرفت. فرآیند همسانه سازی و زیر همسانه سازی با موفقیت انجام گرفت. نمونه های تست در مقایسه با کنترل در مواجهه با IPTG پروتئین نوترکیب قابل تشخیصی را روی ژل SDS-PAGE نشان نداد. این نتیجه با تغییر پارامترهای مختلف (زمان القاء، دما و غلظتهای متفاوت IPTG) تکرار شد. به نظر می رسد توالی طبیعی ژن cfaE دارای میزان A+T بالا و همچنین کدونهای نادر زیادی است که باعث می شود قابلیت تولید بالای پروتئین در E.coli با این الگوی کدونی وجود نداشته باشد. از این رو پیشنهاد می گردد توالی این ژن بعد از بهینه سازی کدونها، سنتز شده و سپس بررسی بیان آن مجددا ارزیابی شود.

با توجه به کاربرد فراوان آنزیمهای لیپولیتیک بخصوص لیپاز باکتریایی در صنایع غذایی، دارویی و بهداشتی از یک طرف و قیمت بالای آن از طرف دیگر، جهت رفع مشکل تولید آنزیم لیپاز باکتریایی، تولید این آنزیم از یک منبع در دسترس و ارزان قیمت مورد بررسی قرار گرفته است. برای این منظور سوش جدید Pseudomonas aeruginosa HR59 از عفونت سوختگی جداسازی و شرایط کشت آن با استفاده ار روش سطح پاسخ برای چهار فاکتور غلظت کلسیم، غلظت توئین-80، غلظت روغن زیتون و زمان انکوباسیون بهینه سازی شده است. نتایج حاصل از این روش آماری نشان داده است که زمان انکوباسیون بیشترین تاثیر و غلظت روغن زیتون کمترین تاثیر مثبت را بر ترشح آنزیم دارند. در نتیجه اعمال شرایط بهینه شده در محیط کشت باکتری (3 میلی مولار کلسیم، V/V 1.5 روغن زیتون،0.4 V/V  توئین-80 و 72 ساعت آنکوباسیون)، ترشح آنزیم به حداکثر مقدار خود می رسد.