پژوهش های آسیب شناسی زیستی
سال:1390 | دوره:14 | شماره:4 |تعداد مقالات:10

هدف: کمپلکس آنتی ژن 85 مایکوباکتریوم توبرکلوزیس شامل سه پروتئین ترشحی است که خاصیت ایمنی زایی دارند. این پروتئین ها کاندیداهای مهمی در طراحی واکسن سل هستند. برای استفاده از این پروتئین ها به عنوان واکسن های زیرواحدی یا به عنوان یادآور برای BCG نوترکیب یا واکسن های DNA، تولید آنتی ژن های پروتئینی به شکل نوترکیب الزامی است. پروتئین های مایکوباکتریوم که در دیواره هستند نسبتا غیرقطبی است و تولید آن ها به شکل نوترکیب در سویه بیانی اشریشیا کلی با پروتئین های دیگر متفاوت است. هدف از این مطالعه تولید و تخلیص آنتی ژن نوترکیب  C85به عنوان یک ایمنوژن است.مواد و روش ها: آنتی ژنC85  در حامل پلاسمیدی pJET1.2 و در نهایت در pET32a(+) کلون و در هر دو پلاسمید تعیین توالی شد. القای تولید پروتئین با IPTG صورت گرفت و تخلیص با حل کردن اجسام توده ای داخل سلولی در اوره، جذب با رزین نیکل، حذف اوره با شیب کاهشی اوره در محلول های شستشو و در نهایت جمع آوری پروتئین نوترکیب به شکل محلول انجام شد. تایید آنتی ژنیک پروتئین نوترکیب با وسترن بلات و توسط آنتی بادی ضد پلی هیستیدین، آنتی سرم پلی کلونال خرگوشی ضد مایکوباکتریوم توبرکولوزیس و سرم بیمار سلی بستری انجام شد.نتایج: ژن آنتی ژن C85 با موفقیت کلون و با تعیین توالی تایید شد. آنتی ژنC85  در میزبان اشریشیا کلی بیان و تخلیص شد.نتیجه گیری: نتایج وسترن بلات به موازات نتایج تعیین توالی نشان دهنده درستی تولید پروتئین آنتی ژنC85  نوترکیب و حفظ نسبی ساختار اپی توپی آن است.

هدف: استفاده از داروهای ضد رتروویروسی تاثیر زیادی در کنترل پیشرفت بیماری ایدز داشته است، اما در سال های اخیر به دلیل به وجود آمدن سویه های مقاوم به دارو، نگرانی زیادی در درمان موثر بیماری به وجود آمده است. هدف از این مطالعه تعیین جهش های مقاومت دارویی ژن پروتئاز در بین بیماران تحت درمان و هم بیمارانی که دارو دریافت نمی کنند، است.مواد و روش ها: در گروه اول پلاسمای 30 بیمار مبتلا به ویروس نقص ایمنی انسان که تحت درمان ضد رتروویرسی نیستند و در گروه دوم پلاسمای 16 بیمار مبتلا به ایدز که ترکیب دارویی زیدوودین، لامیوودین و کلاترا دریافت می کنند، مورد آزمایش قرار گرفت. پس از استخراج ژنوم،Nested RT-PCR  انجام شد و نمونه ها پس از تایید توسط الکتروفورز توالی یابی شد و سپس برای تشخیص جهش و تعیین تحت تیپ ها مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.نتایج: نتایج نشان داد که در نمونه های گروه اول که دارو مصرف نمی کنند، هیچ گونه جهشی رخ نداده است اما در گروه دوم که تحت درمان هستند 40 درصد مقاومت به مهار کننده های پروتئاز وجود دارد. همچنین تعیین تحت تیپ ها نیز نشان می دهد که 50 درصد نمونه ها تحت تیپ A، 40.6 درصد تحت تیپ B، 6.2 درصد تحت تیپ D و 3.2 درصد تحت تیپ C است.نتیجه گیری: انتقال سویه های مقاوم در بین جامعه از نظر اپیدمیولوژیکی مهم است و تشخیص سریع این سویه های مقاوم از اهمیت بسیار بالایی برخوردار است. با توجه به مطالعات دیگران و نتایج مطالعه حاضر بهتر است که به جای کلاترا، یکی دیگر از مهار کننده های پروتئازی را جایگزین این دارو نمایند.

هدف: سلول های بنیادی خون قاعدگی از نظر عملکردی و فنوتیپی به سلول های بنیادی مزانشیمی شبیه هستند. سلول های بنیادی مزانشیمی فعالیت و تولید سلول های دندریتیک را مهار می کنند؛ اما درباره تاثیر سلول های بنیادی خون قاعدگی بر سلول های سیستم ایمنی اطلاعات کمی وجود دارد. در مطالعه حاضر، تاثیر این سلول ها بر تمایز سلول های دندریتیک از مونوسیت بررسی شد.مواد و روش ها: خون قاعدگی از خانم های سالم در دوره قاعدگی تهیه شد. سلول های تک هسته ای چسبان جدا شده و پس از دو هفته کشت، سلول های بنیادی خون قاعدگی به دست آمدند. سلول های مونوسیت در حضور سایتوکین های اینترلوکین 4 و فاکتور محرک کلونی گرانولوسیت-مونوسیت به سمت سلول های دندریتیک در حضور و عدم حضور سلول های بنیادی خون قاعدگی، تمایز داده شدند. پس از 5 روز میزان تولید نشانگرهای سلول های دندریتیک و مونوسیت اندازه گیری شد. میزان تولید سایتوکین اینترلوکین 6 نیز در مایع رویی کشت ها اندازه گیری شد.نتایج: در حضور سلول های بنیادی خون قاعدگی، درصد سلول های دارای نشانگرهای سلول های دندریتیک (CD1a) و مونوسیت (CD14) به ترتیب کاهش و افزایش معنی داری را نشان داد. میزان تولید اینترلوکین 6 در مایع رویی هم کشتی سلول های بنیادی خون قاعدگی با مونوسیت افزایش معنی داری داشت.نتیجه گیری: مطالعه حاضر نشان داد سلول های بنیادی خون قاعدگی تمایز سلول های مونوسیت به دندریتیک را مهار می کنند. این اثر می تواند به افزایش تولید سایتوکین اینترلوکین 6 نسبت داده شود. با توجه به محاسنی که برای سلول های بنیادی خون قاعدگی ذکر شده، این سلول ها می توانند جایگزین مناسبی برای سلول های بنیادی مزانشیمی در کارهای بالینی آینده باشند.

هدف: ویروس آنفلوانزای (H1N1) A از مهم ترین زیرگونه های ویروس آنفولانزاست که منجر به پیامدهای متعددی در جهان شده است. هماگلوتینین یکی از مهم ترین آنتی ژن های این ویروس می باشد که باعث ایجاد پاسخ ایمنی می شود. اتصال این پروتئین به گیرنده های سلول میزبان منجر به شروع فرایند بیماری زایی می شود.با توجه به نقش حیاتی مرحله اتصال ویروسی، این پژوهش درصدد استخراج و جای سازی ژن هماگلوتینین و زیرواحد بزرگ آن (HA1) با هدف تولید شاتل ناقل نوترکیب باکیولوویروس (بکمید) برای تولید پروتئین نوترکیب در سلول های حشره است.مواد و روش ها: ویروس آنفلوانزای انسانی A/New Caledonia 99/20/(H1N1) در کشت سلولی MDCK تکثیر شده و RNA کامل ویروسی توسط محلول Easy–red تخلیص شد. سپس طول کامل ژن هماگلوتینین و ژن HA1 توسط روش RT-PCR و آغازگرهای اختصاصی تکثیر و ابتدا در ناقل pGEM-TEasy و سپس در پلاسمید pFastBac HT جای سازی شد. در نهایت بکمید نوترکیب واجد ژن های فوق در سلول های میزبان DH10Bac تولید شد.نتایج: محصولات PCR ژن هماگلوتینین با الکتروفورز روی ژل آگارز و هضم با آنزیم های محدودالاثر ارزیابی شد. ناقل نوترکیب pGEM-Teasy و پلاسمید دهنده نوترکیب pFastBac HT توسط روش PCR، هضم آنزیمی و تعیین ترادف تایید شد. تولید DNA نوترکیب بکمیدی نیز توسط افتراق کلونی های آبی-سفید، الکتروفورز روی ژل آگارز 0.7 درصد،PCR با استفاده از آغازگرهای اختصاصی و آغازگرهای pUC/M13 مورد تایید قرار گرفت.نتیجه گیری: در این پژوهش، بکمید نوترکیب واجد ژن هماگلوتینین و زیرواحد بزرگ آن با موفقیت ساخته شد. در ادامه سلول های حشرات به منظور تولید باکیولوویروس نوترکیب با سازه های فوق ترانسفکت شده و پروتئین های نوترکیب برای مطالعات آتی تولید خواهد شد.

هدف: ویروس هرپس سیمپلکس تیپ یک پس از آلوده کردن میزبان به صورت طبیعی در گانگلیون نورون تریژمینال به صورت خفته در می آید. در این وضعیت تنها رونوشتی که از ویروس در سلول قابل تشخیص است رونوشت وابسته به نهفتگی (LAT) است که این رونوشت microRNAهایی را تولید می کند که قادر است مسیرهای پیام رسانی در سلول را دستخوش تغییر نماید. یکی از مسیرهای کلیدی پیام رسانی سلول مسیر فاکتور رشد تومور (TGF-b) است. در این مسیر ژن Smad4 به عنوان یک پروتئین مهم رابط بین گیرنده های غشایی کینازهای سیتوپلاسمی و فاکتورهای رونویسی هسته ای است. این تحقیق با بررسی بیان microRNAهای ویروسی در سلول میزبان هدف گیری ژن Smad4 با این microRNAها را بررسی نموده است.مواد و روش ها: پس از ترانسفکت ژن LAT به داخل سلول های BE-2(c)، بیان microRNAهای وابسته به LAT در این سلول ها به کمک واکنش زنجیره ای پلیمراز کمی (Real-Time PCR) ارزیابی شد و به کمک روش های مبتنی بر بیوانفورماتیک امکان هدف گیری ژن Smad4 با این microRNAها نیز بررسی و در ادامه بیان ژن Smad4 و ژن های پایین دست آن به کمک واکنش زنجیره ای پلیمراز کمی مطالعه شد.نتایج: شواهد و نتایج نشان می دهد که رونوشت LAT در سلول میزبان تولید microRNAهایی می کند که تجزیه و تحلیل های بیوانفورماتیکی دو الگوریتم متفاوت گواهی بر هدف گیری ژن Smad4 توسط این microRNAها می دهد این در حالی است که نتایج واکنش زنجیره ای پلیمراز کمی نیز تاییدی بر این ادعاست.نتیجه گیری: نتایج مبتنی بر تجزیه و تحلیل های بیوانفورماتیک و بررسی بیان رونوشت Smad4 و پروتئین های پایین دستش همانند CyclinD،CDK2  و Myc نشان دهنده کنترل بیان این ژن توسط microRNAهای ویروس هرپس سیمپلکس تیپ یک است.

هدف: مطالعات حیوانی نشان می دهند که واکسیناسیون با پپتیدهای اپی توپی منجر به ایمنی حفاظتی می شود. با این وجود غلبه ایمنولوژیکی باید به عنوان یک چالش مهم در این زمینه مورد توجه قرار گیرد. با توجه به مزایای واکسن های اپی توپی علیه عفونت هپاتیت C، در این مطالعه بروز پدیده غلبه ایمنولوژیکی به دنبال ایمن سازی موش ها با سه ترکیب مختلف پپتیدهای اپی توپی ویروس هپاتیت C مقایسه شده است.مواد و روش ها: چهار پپتید اپی توپی وابسته به سلول های CD8+ (C1، E6،N  و E4) برگرفته از آنتی ژن های ویروس هپاتیت C ساخته شد. پپتید چند اپی توپی (C1E6NE4) حاصل از اتصال چهار اپی توپ نیز بر اساس مطالعات ایمونوانفورماتیک با هدف بهینه سازی برش پروتئازوم طراحی شد. موش های BALB/c سه تزریق زیرجلدی شامل 10 میکروگرم پپتید (به صورت پپتید اپی توپی یا مخلوط اپی توپ ها یا پپتید پلی توپ) ترکیب شده با اجوانت های CpG (50 میکروگرم) و MontanideISA720 (70 درصد) را در قاعده دم با فاصله سه هفته دریافت کردند. با توجه به وابستگی دو اپی توپ C1 و E4 به H2-Dd موشی، سه هفته پس از آخرین تزریق از سلول های طحال موش های واکسینه در حضور پپتیدهای C1 و E4 برای آزمون های IFNg/IL4 ELISpot استفاده شد.نتایج: در کلیه حیوانات واکسینه پاسخ Th1 که با مشخصه ترشح بالای اینترفرون گاما و ترشح کم اینترلوکین 4 شناخته می شود ایجاد شده بود. موش های ایمن شده با اپی توپ های تکی پاسخ قوی تری را نشان دادند، اما به علت گرایش بالاتر اپی توپ E4 برای H2-Dd پاسخ علیه آن قوی تر از پاسخ علیه اپی توپ C1 بود که نمایانگر بروز درجاتی از غلبه ایمنولوژیکی است. نکته جالب توجه این که حیوانات واکسینه با پپتید پلی توپ اگر چه با شدت ضعیف تر اما پاسخ یکسانی را علیه هر دو اپی توپ C1 و E4 نشان دادند.نتیجه گیری: نتایج این مطالعه برتری پپتید پلی توپ را بر اپی توپ های تکی نشان داد و بر نقش کلیدی طراحی بهینه واکسن های پلی توپ برای جلوگیری از وقوع غلبه اپی توپی تاکید نمود.

هدف: بررسی اثر تزریق سلول های بنیادی مزاشیمی جدا شده از بافت چربی و محیط رویی کشت این سلول ها بر ارتشاح لکوسیتی مغز موش های مبتلا به آنسفالومیلیت خودایمن تجربی مواد و روش ها: در 20 سر موش ماده C57BL/6 مدل آنسفالومیلیت خودایمن تجربی القا و سپس موش ها به چهار گروه پنج تایی تقسیم شدند و پس از 15 روز، زمانی که تقریبا شدت بالینی علایم به یک رسید، به دو گروه از موش ها 106 عدد سلول بنیادی مزانشیمی جدا شده از بافت چربی موش  C57BL/6به صورت درون رگی و 106×2 عدد سلول بنیادی مزانشیمی جدا شده از بافت چربی به درون صفاق و به یک گروه از آن ها 6 نوبت محیط رویی کشت سلول های بنیادی مزانشیمی و هر نوبت یک سی سی به صورت درون صفاقی تزریق شد. یک گروه از موش ها نیز بدون هیچ تیماری به عنوان گروه کنترل باقی ماند. پس از 60 روز اثر سلول ها و محیط رویی کشت این سلول ها بر ارتشاح لوکوسیتی مغز در چهار گروه با هم مقایسه شد.نتایج: ارتشاح لوکوسیتی در گروه هایی که سلول بنیادی مزانشیمی و محیط رویی کشت سلول های مزانشیمی را دریافت کرده بودند در مقایسه با گروه کنترل آنسفالومیلیت خود ایمن تجربی که هیچ تیماری دریافت نکرده بود، کاهش معنی داری نشان داد (P<0.05). وزن و میزان بقای موش های تیمار شده در مقایسه با گروه کنترل افزایش داشت.نتیجه گیری: سلول های بنیادی مزانشیمی جدا شده از چربی خواص تنظیمی ایمنی و ترمیم بافت عصبی دارند که می تواند سبب بهبود موش های مبتلا به آنسفالومیلیت خودایمن تجربی در مقایسه با گروه کنترل شود.

هدف: باسیلوس سرئوس باکتری گرم مثبت و اسپورزایی است که به طور وسیعی در طبیعت انتشار دارد. بسیاری از سویه های این باکتری باعث مسمومیت غذایی با علایم اسهال و استفراغ می شوند. بیماری های نوع اسهالی توسط انتروتوکسین های همولیزین HBL، غیرهمولیتیک NHE و سیتوتوکسین K ایجاد می شود. برنج یکی از غذاهای پرمصرف در ایران است که ممکن است توسط باسیلوس سرئوس آلوده شود. هدف از این تحقیق بررسی حضور ژن های انتروتوکسیژنیک کمپلکس NHE باسیلوس سرئوس های جدا شده در تعدادی برنج های خردیداری شده استان زنجان بود.مواد و روش ها: تعداد ده نمونه برنج به طور تصادفی از فروشگاه ها خریداری شد. از هر نمونه برنج و با استفاده از محیط کشت انتخابی (PEMPA)، باسیلوس سرئوس جداسازی شد. روی این کلونی های جدا شده آزمون های تاییدی بیوشیمیایی انجام گرفت، همچنین تشخیص مولکولی باسیلوس سرئوس با استفاده از آغازگرهای اختصاصی انجام شد. سپس نمونه های تایید شده از نظر باسیلوس سرئوس برای ژن های کمپلکس NHE با آغازگر های اختصاصی و با روش PCR چندگانه بررسی شدند.نتایج: مطابق یافته ها تمام نمونه های برنج مورد مطالعه با باکتری های باسیلوس سرئوس آلوده بودند و در هشت نمونه از باکتری های جدا شده ژن های کمپلکس NHE مشاهده شد.نتیجه گیری: با توجه به این که باسیلوس سرئوس می تواند دماهای بالا را تحمل کند، در برنج پخته شده اسپور ها می توانند در اثر حرارت مجدد جوانه بزنند. PCR چندگانه برای کمپلکس NHE روش سریع و مطمئنی برای شناسایی باسیلوس سرئوس انتروتوکسیژنیک از غیر انتروتوکسیژنیک است. با وجود آن که که برنج رژیم اصلی ایران است، مطالعه کمی از نظر میکروبیولوژی روی این ماده غذایی صورت گرفته است. افزایش اطلاعات درباره بیماری زایی و شیوع ژن های مهم در مسمومیت غذایی می تواند در پیشگیری از مسمومیت های غذایی موثر باشد.

هدف: برای نگهداری DNA میکروارگانیسم ها از روش های سنتی نگهداری در دمای پایین 4، 20- و 80- درجه سانتی گراد استفاده می شود. کارت DBC یک روش نوین نگهداری DNA در دمای اتاق است. پ‍‍ژوهش حاضر به منظور بررسی پایداری DNA باکتری و تعیین بهترین روش نگهداری DNA روی کارت نگهداری DNA طراحی شد.مواد و روش ها: از یک جفت آغازگر از قسمت حفاظت شده دومین16 srRNA  برای شناسایی اشریشیا کلی استفاده شد و چهار نوع مختلف نمونه باکتریایی شامل سوسپانسیون باکتری،DNA خالص باکتری به روش فنل-کلروفرم، باکتری لیز شده با بافر لیز کننده و DNA باکتری با روش جوشاندن تهیه و در روی کارت جداگانه ریخته و در دمای اتاق خشک شد. سپس در زمان های 3، 5 و 7 ماه پایداری DNA باکتری اشریشیا کلی با دو روش مولکولی PCR مرسوم با تعداد 1، 2، 3 دیسک (به قطر 1 میلی متر) به عنوان منبعی از DNA باکتری و Real-Time PCR بررسی شد.نتایج DNA :باکتری پس از هفت ماه روی یک دیسک از کارت نگهداری DNA پایداری خود را حفظ نمود و حتی یک پانچ از دیسک به عنوان منبع DNA کافی بود. اما نتایج بررسی حاضر نشان داد که سوسپانسیون باکتری بهترین روش نگهداری طولانی مدت DNA باکتری روی کارت نگهداری DNA است.نتیجه گیری: در روش های سنتی نگهداری DNA، پس از منجمد و ذوب شدن DNA کیفیت آن کاهش می یابد اما در روش کارت نگهداری DNA کیفیت DNA برای زمان طولانی تر حفظ می شود و علاوه برآن این روش مزایایی مانند آسانی در کارکردن با نمونه، قیمت پایین، تخلیص سریع تر و در نهایت کاهش آلودگی فردی و محیطی را دارد.