پژوهش های آسیب شناسی زیستی
سال:1390 | دوره:14 | شماره:2 |تعداد مقالات:11

هدف: مطالعه اریتروپوئز نیاز به توسعه روش های کشت سلول های پیش ساز اریتروئیدی با استفاده از توان سلول های بنیادی، برای تمایز به رده های مختلف سلول های خونی دارد. در این مطالعه، تمایز سلول های بنیادی خون بند ناف به سلول های پیش ساز اریتروئیدی در یک محیط کشت نیمه جامد انجام شد. مواد و روش ها: سلول های تک هسته ای از خون بند ناف استخراج شده و در محیط کشت مایع حاوی فاکتورهای تمایز دهنده اریتروئیدی کشت شدند (مرحله اول کشت). سلول های غیر چسبنده در محیط نیمه جامد حاوی فاکتورهای رشد سلول بنیادی، اینترلوکین 3، اینترلوکین 6، اریتروپویتین کشت شدند (مرحله دوم کشت). پس از گذشت یک هفته، کلونی های اریتروئیدی ظاهر شده از محیط کشت نیمه جامد برداشته شدند. برای تعیین هویت سلول های تمایز یافته، تجزیه و تحلیل فلوسیتومتری برای سنجش CD235a و CD36، ارزیابی سیتولوژی توسط رنگ آمیزی گیمسا و بررسی بیان ژن های GATA-1، EKLF و آلفا - گلوبین توسط RT-PCR انجام گرفت. نتایج: تجزیه و تحلیل فلوسیتومتری نشان داد که تمایز یافته، شاخص های سلولی ویژه اریتروئیدی CD36 و CD235a را به ترتیب در حد 94.3 درصد و 95.5 درصد دارا هستند. ریخت شناسی این سلول ها در گستره های رنگ آمیزی شده با رنگ گیمسا، طیف سلول های پیش ساز اریتروئیدی از پرواریتروبلاست تا ارتوکروماتیک اریتروبلاست را اثبات نمود. نتایج RT-PCR تایید نمود که سلول های تمایز یافته پیش سازهای رده اریتروئیدی هستند و ژن های GATA-1، EKLF و آلفا گلوبین را بیان می کنند. نتیجه گیری: سلول های بنیادی خون بند ناف قابلیت بالایی برای تمایز به سلول های پیش سازهای اریتروییدی با روش شرح داده شده دارند که می توان از آن برای مطالعات آزمایشگاهی بهره گرفت.

هدف: اینترلوکین 18 سایتوکاینی است که نقش مهمی در پاسخ سلول های T کمکی نوع یک بازی می کند و بنابراین پلاسمید بیان کننده آن، به عنوان یک ادجوانت قوی ژنتیکی در زمینه مطالعه واکسن های DNA به شمار می رود. در این مطالعه پلاسمید جفت بیانی کد کننده اینترلوکین 18، ترشحی (و به صورت متصل با قسمتی از FCg2a) ساخته شد و بیان این سایتوکین نوترکیب ارزیابی شد. مواد و روش ها: RNA از سلول های تحریک شده طحال موش استخراج و با استفاده از RT-PCR قطعات cDNA متعلق به اینترلوکین 18 موشی (mIL-18) و بخشی از توالی FCg2a ساخته شد. در ادامه به منظور ساخت قطعه mIL-18/Fc ابتدا قطعات FC و اینترلوکین 18 موشی در پلاسمید pSL1180 وارد شده و سپس این قطعه در پلاسمید pSectag2a به منظور اضافه شدن توالی نشانه کاپای ایمنوگلبولین (Igk) کلون شد. در نهایت Igk/mIL-18/Fc درمیان سایت آنزیمی NheI/XmaI، پایین دست ناحیه پروموتوری سیتومگالوویروس، در ناقل pIRES2-EGFP کلون و پلاسمید pIRES-Igk/mIL-18/Fc ساخته شد. سپس این پلاسمید در رده سلولی HEK293T به وسیله محلول ترانسفکشن توربوفکت ترانسفکت شده و بیان آن با روش الایزا ارزیابی شد. نتایج: بررسی هضم آنزیمی پلاسمیدهایpSec-mIL-18/Fc, pSL-mIL-18/Fc, pSL-mIL-18  و pIRES-Igk/mIL-18/F، با استفاده از آنزیم های اختصاصی مورد استفاده در کلونینگ، منجر به جداسازی قطعات مورد انتظار شد و سپس درستی ترادف و قالب بیان پلاسمید pIRES-Igk/mIL-18/F با روش توالی یابی تایید شد. علاوه بر این بیان و ترشح سایتوکین نوترکیب در محلول رویی سلول های ترانسفکت شده HEK293T در مقایسه با کنترل ترانسفکت تایید شد.نتیجه گیری: در حالی که پلاسمید pIRES-Igk/mIL-18/Fc قابلیت کلونینگ و بیان آنتی ژن مدنظر را داشته، همچنین قابلیت بیان پروتئین اینترلوکین 18 را به عنوان یک ادجوانت قوی ژنتیکی را به همراه دارد. این نتایج در طراحی یک واکسن DNA کارا به منظور ارتقای پاسخ ایمنی سلولی مفید بوده و علاوه بر این هدفی جدید در راستای دستیابی به نسل جدید از واکسن DNA به حساب می آید.

هدف: بررسی تاثیر پارابنزوکواینون و هیدروکواینون بر بیان ژن RUNX2 (ژنی کلیدی در مسیر تمایز استئوبلاستی) و تمایز استخوانی سلول های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان.مواد و روش ها: با کشت دادن سلول های تک هسته ای مغز استخوان، سلول های بنیادی مزانشیمی تهیه شدند، پس از تیمار این سلول ها با غلظت 10 میکرومولار هر یک از دو ترکیب پارا - بنزوکواینون و هیدروکواینون، بیان ژن RUNX2 توسط روش Real-Time RT PCR در ساعت های 1، 6، 24 و 48 پس از تیمار ارزیابی شد و تمایز استئوبلاستی این سلول ها نیز توسط روش های رنگ آمیزی آلیزارین قرمز و آلکالین فسفاتاز در روزهای 7 و 14 پس از القای تمایز با استفاده از محیط کشت القا کننده، بررسی شد. نتایج: بیان ژن RUNX2 در سلول های تیمار شده نسبت به کنترل افزایش چشمگیر (تا حدود 8 برابر) نشان داد ولی تغییر چشمگیری در روند تمایز استئوبلاستی مشاهده نشد. نتیجه گیری: با توجه به منابع علمی، افزایش بیان ژن RUNX2 برای بروز تمایز استئوبلاستی ضروری بوده ولی به تنهایی کافی نیست، بنابراین افزایش مشاهده شده در بیان این ژن در پژوهش حاضر، معرف القا یا تسریع در روند تمایز استئوبلاستی نیست. این افزایش می تواند شاخص افزایش فعالیت مسیر انتقال نشانه Wnt اصلی بوده و به این ترتیب بیانگر دخالت این مسیر انتقال نشانه در بروز لوسمی میلوییدی حاد ناشی از مجاورت با متابولیت های بنزن باشد. از سوی دیگر، این افزایش بیان مشاهده شده در سلول های بنیادی مزانیشیمی در حضور ترکیبات مذکور می تواند نشان دهنده افزایش بیان RUNX2 در سلول های پیش ساز میلوییدی به عنوان تاثیر مشابه مجاورت با بنزن و متابولیت های آن باشد و به این صورت در بزوز لوسمی میلوییدی حاد ناشی از مجاورت با بنزن نقش داشته باشد.

هدف: کورکومین جز فعال گیاه زردچوبه است که با مهار چند مسیر پیام رسانی درون سلولی قادر به القای مرگ برنامه ریزی شده سلولی است. با این حال حلالیت بسیار ضعیف آن در محیط آبی باعث محدودیت استفاده از این ترکیب ارزشمند شده است. در این مطالعه از دندروزوم به خاطر حلالیت در آب، داشتن ابعاد نانو و عدم سمیت سلولی برای انتقال کورکومین به سلول استفاده شده است. مواد و روش ها: در این پژوهش، قابلیت دندروزوم ها در رسانش کورکومین به سلول های hBMSC, 5637, HT3, AGS و U87 مورد مطالعه قرارگرفت. برای انتخاب بهترین غلظت دارویی و رده سلولی، غلظت های مختلف کورکومین در حالت آزاد و قرار گرفته در دندروزوم بر رده های سلولی تاثیر داده شد. سپس میزان القای مرگ برنامه ریزی شده سلولی به کمک رنگ پروپیدیوم آیوداید و میزان بیان ژن Bax به روش RT-PCR نیمه کمی بررسی شد. نتایج: فرمول بندی دندروزومی کورکومین باعث افزایش قابل توجه حلالیت این ماده شدیدا آب گریز در سلول های AGS شد. به طوری که به روش فلوسایتومتری القای مرگ برنامه ریزی شده سلولی بعد از 18 ساعت در سلول های تحت تیمار با فرمول بندی دندروزومی کورکومین 48 درصد و با کورکومین آزاد 20 درصد با غلظت بهینه دارو (20 میکروگرم در هر میلی لیتر) مشاهده شد. همچنین به روش RT-PCR نیمه کمی افزایش سطح بیان ژن القای کننده مرگ برنامه ریزی شده سلول Bax در فرمول بندی دندروزومی نشان داده شد. نتیجه گیری: بر اساس نتایج، دندروزوم باعث افزایش حلالیت و القای سریع تر و بیشتر کورکومین در مقایسه با کورکومین آزاد می شود. به طوری که افزایش بیان 50 درصدی Bax در سلول های تحت تیمار نیز این مساله را تایید نمود.

هدف: در این پژوهش در راستای راه اندازی یک واکسن جامع بر اساس واکسن ژنی، دو ژن محافظت شده در سویه ها و زیرگونه های مختلف ویروس آنفلوانزا (M1 و نوکلئوپروتئین) در ناقل دوسیسترونی یوکاریوتی بیان شد. مواد و روش ها: پلاسمیدهای M1-pIRES2-EGFP و pIRES2-NP به ترتیب با کلون کردن محصولات PCR ژن های M1 و نوکلئوپروتئین برگرفته از ویروس آنفلوانزا H1N1 سویه A/Peurto Rico/8/34 در داخل ناقل بیانی pIRES2-EGFP ساخته شد. به منظور ساخت پلاسمید دو سیسترونی M1-pIRES2-NP، ژن M1 از پلاسمید M1-pIRES2-EGFP استخراج و در پلاسمید pIRES2-NP ساب کلون شد. در نهایت بررسی بیان این دو پروتئین در سلول های یوکاریوتی با ترانسفکشن کلون ساخته شده به داخل سلول BHK-21 با استفاده از ایمونوفلوئورسنس غیر مستقیم انجام شد. نتایج: موفقیت در کلونینگ صحیح ژن های مذکور با هضم آنزیمی و تعیین توالی قطعات کلون شده به اثبات رسید. بیان صحیح این دو ژن در سلول های یوکاریوتی با ترانسفکشن این کلون در رده سلولی BHK-21 و بررسی با روش ایمونو فلورسنس به اثبات رسید. نتیجه گیری: بیان همزمان دو ژن M1 و نوکلئوپروتیئن ویروس آنفلوانزا در یک سازه ژنی با واسطه توالی IRES ممکن است.

هدف: هدف از این تحقیق ساخت و بررسی اثر نانوحامل های پلی آمیدوآمین - پلی اتیلن گلیکول هدفمند شده با نانوبادی علیه TAG72 برای انتقال سازه کد کننده ژن t-Bid به سلول های آدنوکارسینومای کولون انسانی است. مواد و روش ها: ساب کلونینگ ژن نانوبادی در ناقل بیانی pSJ برای تولید انبوه پروتئین نانوبادی انجام و سپس نانوبادی با کاربرد ستون نیکل جداسازی شد. فرآیند جداسازی با SDS-PAGE و وسترن بلاتینگ تایید شد. افزودن پلی اتیلن گلیکول به نانوذرات پلی آمیدوآمین با نسبت مولی 1 به 2 (پلی آمیدوآمین به پلی اتیلن گلیکول) و هدفمندسازی با نانوبادی علیه TAG72 با نسبت مولی 1 به 1 انجام شد. بار سطحی و اندازه نانوذرات به ترتیب با دستگاه زتا سایزر مالورن و نانوسایت بررسی و کارایی حامل ژنی ساخته شده در انتقال ژن کشنده t-Bid به سلول های آدنوکارسینومای کولون در محیط آزمایشگاه با آزمون های Real Time PCR و تعیین میزان مرگ و میر سلولی بررسی شد. نتایج: نتایج بررسی با نانوسایت و زتا سایزر مالورن، به ترتیب ساخت نانوذرات هدفمند با اندازه 92±162 نانومتر و پتانسیل سطحی 4.57+ را نشان می دهد. آزمون تاخیر حرکت در ژل، کارآیی حامل ساخته شده را برای دربرگیری و فشرده سازی سازه ژنی تایید می کند. نتایج Real Time PCR افزایش بیان ژن هدف در سلول های توموری را تایید می کند. نتیجه گیری: نتایج این مطالعه کارآیی دندریمرهای پلی آمیدوآمین در انتقال ژن و نیز تاثیر مثبت افزودن پلی اتیلن گلیکول و اتصال نانوبادی علیه TAG72 به این نانوحامل ژنی (برای هدفمندسازی انتقال ژن به سلول) را تایید می کند.

هدف: مطالعات اخیر نشان داده است که استفاده از اکسیژن با غلظت بالا (هایپرکسی 95 درصد) در فشار طبیعی جو (نورموکسی) به صورت متناوب یا پیوسته می تواند آسیب های ناشی از سکته مغزی را کاهش دهد. هدف از این تحقیق بررسی اثر اکسیژن رادیکالی در تحمل به ایسکمی مغزی بعد از تیمار با هایپرکسی نورموباریک به صورت متناوب در بافت مغزی رت در محیط درون بدنی است.مواد و روش ها: رت های نژاد ویستار در محدوده وزنی 250 الی 350 گرم در دو گروه اصلی آزمایشی به مدت 6 روز در معرض 4 ساعت اکسیژن 90 درصد (HO) و گروه اصلی کنترل در معرض اکسیژن اتاق 21 درصد در فشار 1 اتمسفر (RA) داخل جعبه مخصوص قرار گرفتند. هر گروه اصلی به سه زیر گروه فرعی تقسیم شدند. زیر گروه اول هیچ ماده ای دریافت نکرد (RA و HO) و زیرگروه های دوم و سوم نیم ساعت قبل از قرارگیری در جعبه اکسیژن به ترتیب سالین (RA-S و HO-S) و دی متیل تیواوره (RA-MT و HO-MT) دریافت کردند. رت ها 24 ساعت بعد در معرض جراحی ایسکمی مدل انسداد شریان میانی مغزی قرار گرفتند. بعد از 60 دقیقه ایسکمی نوبت به 24 ساعت خون رسانی مجدد رسید. آن گاه رفتارهای شاخص نقص نورولوژیک و حجم سکته مغزی بررسی شدند. نتایج: میانگین امتیازهای نقص نورولوژیک در گروه HO-S, HO-MT, RA-S, RA-MT, RA و HO به ترتیب 1.85، 1.71، 2.42، 2.14، 0.42، و 0.57 بود. همچنین حجم سکته در گروه کنترل نشان می دهد که کاهش معنی دار حجم سکته با پیش شرطی سازی هایپرکسی نورموباریک رخ می دهد در حالی که با مصرف دی متیل تیواوره این اثر تا حد زیادی از بین می رود. نتیجه گیری: حفاظت عصبی بعد از تیمار با هایپرکسی نورموباریک به طور متناوب به مقدار زیادی به واسطه رادیکال های اکسیژن صورت می گیرد.

هدف: ارزیابی تاثیر آلودگی توکسوپلاسما گوندی بر روند اسپرماتوژنز رت بالغ مواد و روش ها: تاکی زوئیت سوش RH توکسوپلاسما گوندی به 35 سر رت به عنوان گروه آلوده به صورت داخل صفاقی تزریق شد و 21 سر رت نیز در گروه شاهد قرار داده شد. سپس هر 10 روز در فاصله روزهای 10 تا 70 پس از آلودگی، 5 سر رت آلوده و 3 سر رت گروه شاهد کشته و درصد نسبی وزن بیضه به بدن و همچنین پارامترهای اسپرم و میزان فروکتوز وزیکول سمینال و غدد بررسی شد. به منظور تشخیص آلودگی در رت ها، کیت IgG الایزا طراحی شد. نتایج: تمام رت ها که به آن ها تاکی زوئیت توکسوپلاسما گوندی تزریق شده بود از روز 10 تا 70 پس از آلودگی از نظر سرمی مثبت بودند. تحرک اسپرم از روز 10 تا 70، میزان زنده بودن اسپرم ها از روز 10 تا 60، تعداد اسپرم از روز 20 تا 60 بعد از آلودگی، کاهش معنی دار و درصد اسپرم های غیرطبیعی در روزهای 30، 40 و 50 پس از آلودگی، افزایش معنی داری در رت های آلوده داشت (P<0.05). درصد نسبی وزن بیضه به بدن در رت های آلوده و شاهد اختلافی نداشت (P>0.05). میزان فروکتوز وزیکول سمینال از روز 10 تا 50 پس از آلودگی کاهش معنی داری در رت های آلوده نسبت به گروه شاهد نشان داد (P<0.05). نتیجه گیری: با توجه به نتایج به دست آمده، توکسوپلاسموزیس می تواند باعث اختلال موقت و دوره ای اسپرماتوژنز و باروری رت بالغ شود.