آلودگی میکروبی (قارچی و باکتریایی) محیط کشت یکی از مشکلات شایع در ریزازدیادی درون شیشه ای گیاهان است. در پژوهش حاضر دستیابی به بهترین روش سترون سازی و بهینه سازی تهیه محیط کشت برای تکثیر پینه و باززایی گیاه در سه رقم تجاری نیشکر ایران (CP48-103، CP69-1062و CP57-164) مورد مطالعه قرار گرفت. به منظور سترون سازی محیط کشت، 12 تیمار در 12 تکرار در یک طرح کاملا تصادفی برای هر رقم به طور جداگانه بررسی شد. به منظور گزینش بهترین محیط کشت تکثیر پینه، 5 تیمار شامل (2 mg l-1) 2, 4-D به همراه سطوح مختلفBAP در 10 تکرار و برای دستیابی به بهترین محیط کشت باززایی، 15 تیمار در 10 تکرار شامل سطوح متفاوت اکسین و سیتوکنین در طرح کاملا تصادفی موردبررسی قرار گرفت. تیمار حاوی کاربندازیم دو در هزار (15 دقیقه)، اتانول 70 درصد (50 ثانیه)، هیپوکلریت سدیم 25 درصد (حاوی پنج درصد کلر فعال) به همراه تویین 20 (15 دقیقه) و محیط کشت حاوی سفوتاکسیم (200 پی پی ام) و جنتامایسین (پنج پی پی ام) با عدم آلودگی در ارقام CP69-1062 وCP57-164 و کم ترین درصد آلودگی برای رقم CP48-103 بهترین نتیجه را در سترون سازی به همراه داشت. در بررسی رشد پینه ها، تیمار TC5 شامل (2 mg l-1) 2, 4-D + (0. 5 mg l-1) BAP + MS بیش ترین رشد و تکثیر پینه را نشان داد. پس از گذشت 45-30 روز از کشت پینه ها روی محیط باززایی، تیمارهای (0. 5 mg l-1 Kinetin و(0. 5 mg l-1 BAP، (3 mg l-1 Kinetin و0. 5 mg l-1 NAA) و (3 mg l-1 Kinetin و0. 1 mg l-1 NAA) به ترتیب در رقم های CP48-103، CP57-164و CP69-1062 با میانگین 70، 60 و 50 درصد بالاترین درصد باززایی گیاه را به همراه داشتند.